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腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型的構(gòu)建及中藥半枝蓮藥效評價應用研究(下)

3.1腦膠質(zhì)瘤芯片模型內(nèi)的細胞生長情況

通過分析U251芯片模型中培養(yǎng)的細胞的表型和活力,評估該模型內(nèi)腦膠質(zhì)細胞瘤細胞的活性。在不改變培養(yǎng)條件的情況下,以1×107個/ml細胞密度接種構(gòu)建芯片模型,培養(yǎng)48 h后進行活力和表型分析。圖2A為明場下細胞形態(tài),圖2B為模型內(nèi)的細胞形態(tài),U251細胞在芯片內(nèi)呈不規(guī)則的3D結(jié)構(gòu)生長。圖2C為培養(yǎng)48 h后U251細胞活/死評估的熒光圖像,絕大多數(shù)為呈現(xiàn)綠色熒光的活細胞,表明模型內(nèi)大部分細胞存活。與0 h芯片內(nèi)U251細胞活力相比,U251細胞在芯片中培養(yǎng)48 h后仍顯示出較高的活力水平(>91%),說明細胞在芯片內(nèi)培養(yǎng)48 h后生長狀態(tài)良好,可以用于后續(xù)的藥效評價研究(圖2D)。

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3.2腫瘤微環(huán)境表征結(jié)果

在腫瘤細胞高速生長與增殖的過程中,往往會伴隨缺氧環(huán)境的形成。為確定芯片模型中U251細胞是否處于低氧環(huán)境,通過免疫熒光染色,對2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)模型中的U251細胞進行HIF-1α的表征。如圖3所示,在3D培養(yǎng)的芯片模型中,缺氧狀態(tài)標記物HIF-1α的熒光強度高于2D細胞培養(yǎng)模型,說明在3D培養(yǎng)條件形成的立體環(huán)境中,部分區(qū)域細胞處于相對缺氧狀態(tài),可能產(chǎn)生更強的缺氧反應;而在2D培養(yǎng)條件下,細胞間相互作用和信號傳導較為簡單,氧氣分布比較均勻,細胞的缺氧反應相對較弱。

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3.3模型內(nèi)陽性藥活性評價結(jié)果

為了評估該芯片模型在研究藥物抗腦膠質(zhì)瘤活性的適用性,分別考察了兩種抗腦膠質(zhì)瘤陽性藥物,即TMZ和DOC,在2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下對細胞活力的影響,結(jié)果如圖4所示。陽性藥TMZ和DOC對U251細胞具有一定程度的殺傷作用,隨著濃度的升高,細胞存活率逐漸降低;與2D培養(yǎng)相比,3D培養(yǎng)芯片模型內(nèi)的U251細胞在暴露于不同濃度TMZ(100、200、300、400 μmol/L)和DOC(2.5、5、10、20 μmol/L)的細胞活力均較高,其中,200 μmol/L和400 μmol/L的TMZ組(圖4A)和20 μmol/L的DOC組(圖4B)細胞活力均顯著高于相應的2D培養(yǎng)組(P<0.05)。表明在相同濃度條件下,3D條件培養(yǎng)的芯片內(nèi)缺氧微環(huán)境或細胞外基質(zhì)能為細胞生長提供更穩(wěn)定的條件,促進腫瘤細胞生長,從而表現(xiàn)出模型內(nèi)細胞活力更高。

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3.4 陽性藥對模型內(nèi)細胞凋亡的影響

通過JC-1熒光探針監(jiān)測細胞線粒體膜電位,評估芯片模型內(nèi)細胞凋亡情況,以細胞活力更高的3D培養(yǎng)芯片模型作為研究平臺,并選擇陽性藥TMZ和DOC評價該芯片模型用于研究藥物抗腦膠質(zhì)瘤活性的可行性,結(jié)果如圖5所示。通常在健康細胞的線粒體內(nèi),JC-1以高膜電位的紅色熒光聚集體形態(tài)存在;在不健康或發(fā)生凋亡的細胞線粒體中,JC-1則以綠色熒光的單體形式呈現(xiàn)。分別使用TMZ和DOC處理后,3D芯片模型內(nèi)U251細胞的紅/綠熒光強度比率隨著藥物濃度的增加而降低,說明細胞內(nèi)線粒體膜電位隨著陽性藥濃度的升高而下降,其中,400 μmol/L的TMZ組(圖5A)、10 μmol/L和20 μmol/L的DOC組(圖5B)與對照組相比,對U251細胞凋亡的影響有顯著性差異,說明這兩種陽性藥均可通過誘導細胞凋亡殺傷U251細胞。以上結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的U251細胞微流控芯片模型具有評價藥物抗腫瘤藥效的能力,可以應用于膠質(zhì)瘤細胞的毒性評價和凋亡評價,為后續(xù)應用于中藥抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價奠定基礎(chǔ)。

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3.5半枝蓮提取液抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價

3.5.1對U251細胞的毒性實驗結(jié)果

采用CCK-8法考察不同濃度的半枝蓮提取液對U251細胞的毒性,確定適宜的給藥濃度。結(jié)果如圖6所示,在0.5~8 mg/ml的濃度范圍內(nèi),U251細胞的存活率隨著半枝蓮提取液濃度的增加而降低。為確保所選藥物濃度能夠有效殺傷U251細胞,同時避免濃度過高導致的非特異性毒性,本研究選擇2 mg/ml的半枝蓮提取液進行后續(xù)實驗。

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3.5.2基于U251芯片模型的半枝蓮提取液抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價

在所建立的U251芯片模型上考察半枝蓮提取液對U251細胞的殺傷作用,通過活/死細胞染色和凋亡實驗評價半枝蓮提取液的藥效,結(jié)果如圖7所示。2 mg/ml的半枝蓮提取液能在一定程度上降低細胞活力,與2D培養(yǎng)(平均細胞活力為64.82%)相比,3D培養(yǎng)的芯片上細胞活力更高(平均細胞活力為90.52%),提示在3D培養(yǎng)條件下可能需要更大劑量的半枝蓮提取液才能對腦膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生殺傷效果。此外,凋亡實驗結(jié)果顯示,2D培養(yǎng)條件下有更多的細胞出現(xiàn)了線粒體膜電位降低的情況,而3D培養(yǎng)條件下呈綠色熒光的JC-1單體較少,說明3D培養(yǎng)的細胞發(fā)生凋亡的較少。綜上表明半枝蓮提取液在一定程度上可以殺傷U251細胞,誘導細胞凋亡,同時提示基于傳統(tǒng)2D培養(yǎng)模型的藥物篩選或藥效評價結(jié)果與更接近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的3D培養(yǎng)系統(tǒng)之間存在一定差距。

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4.討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲性和腫瘤細胞對化療藥物的耐受性使治療面臨重大的挑戰(zhàn)。盡管醫(yī)學科學研究取得了重大進步,但神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預后仍然較差,手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)治療方法效果不佳。目前,體外研究采用的細胞模型僅提供微觀層面的信息,無法模擬腦和腦腫瘤的解剖、功能和微環(huán)境狀況。因此,近年來的研究專注于開發(fā)更先進的細胞培養(yǎng)模型,能夠更好地模擬腫瘤細胞與復雜微環(huán)境之間的相互作用,以腫瘤球體、類器官、3D打印和微流控芯片模型等為代表的3D培養(yǎng)方式可構(gòu)建較為理想的模擬腫瘤微環(huán)境的模型,為腫瘤細胞的增殖提供了合適的環(huán)境,并可作為體內(nèi)腫瘤誘導的載體,從而可以研究腫瘤生長、侵襲以及與免疫系統(tǒng)的相互作用。

腫瘤微環(huán)境的細胞和非細胞成分都有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生,腫瘤微環(huán)境的改變可以促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、進展、侵襲和治療耐藥性。基質(zhì)膠作為一種用于體外培養(yǎng)和模擬生物組織環(huán)境的生物材料,其物理性質(zhì)和功能上高度模擬天然細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵特征,為腫瘤細胞提供支撐和3D結(jié)構(gòu),有助于細胞黏附、生長和分化,可以更完整地在體外模擬腫瘤微環(huán)境。PDMS具有透氣性、透光性、生物相容性以及易加工和成本低等特征,本研究使用的微流控芯片模型集PDMS應用優(yōu)勢和微流控在時空間維度精確控制的特點,實現(xiàn)模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的細胞培養(yǎng),為腦膠質(zhì)瘤體外模型構(gòu)建、藥效評價和藥物篩選提供靈活可控的研究平臺。

腦膠質(zhì)瘤動物模型因其存在基因和分子水平特征、腫瘤微環(huán)境等與人類存在差異、低通量、耗時長以及倫理問題等問題,細胞模型僅由腫瘤細胞組成,易發(fā)生遺傳變異和缺乏腫瘤微環(huán)境等缺點,導致腦膠質(zhì)瘤候選治療藥物在臨床前試驗評估的失敗率極高。與動物模型和傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)的細胞模型相比較,本研究采用人源的U251細胞構(gòu)建的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型在形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及缺氧微環(huán)境的表達等方面更接近真實的腫瘤生長環(huán)境。作為體外研究模型,腫瘤細胞在該微流控芯片模型內(nèi)的存活率、凋亡和對治療的反應等方面表現(xiàn)出更接近體內(nèi)的行為,更真實地評估模型內(nèi)腫瘤細胞對藥物或其他外界刺激產(chǎn)生的反應。因此,本研究中建立的微流控芯片模型在研究腫瘤生長、侵襲、藥物評價和篩選具有一定優(yōu)勢。

腦膠質(zhì)瘤的標準治療包括最大限度的手術(shù)切除、隨后的放療和TMZ同步化療,但許多小分子抑制劑和免疫治療策略都未能改善預后。中醫(yī)藥治療腦膠質(zhì)瘤具有一定優(yōu)勢,包括改善臨床癥狀、減輕放療和化療的不良反應、提高患者生存質(zhì)量等。目前認為中醫(yī)藥防治腦膠質(zhì)瘤的作用機制主要與改善腦膠質(zhì)瘤免疫抑制微環(huán)境,促進腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡及抑制其增殖、侵襲、遷徙,抑制腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)血管生成,調(diào)節(jié)BBB通透性,促進氧化應激相關(guān),同時還能夠提高腫瘤細胞對放化療的敏感性,減輕其不良反應,降低腫瘤耐藥性和復發(fā)的風險。中藥半枝蓮具有清熱解毒,化瘀利尿的功效,現(xiàn)代藥理研究表明半枝蓮具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌、消炎等作用,可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達等,調(diào)控相關(guān)信號通路的相互作用,抑制腦膠質(zhì)瘤血管生成網(wǎng)絡(luò)機制的形成,發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的作用。有研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮80%乙醇提取物對人膠質(zhì)瘤細胞具有明顯的抑制遷移、侵襲作用,并具有濃度相關(guān)的抑制細胞存活率、促凋亡活性。He等研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮活性成分野黃芩苷對人膠質(zhì)瘤細胞U251和LN229的增殖、遷移和凋亡均有抑制作用,其作用機制可能與抑制PSEN 1/PI 3 K-AKT信號通路有關(guān)。相比之下,本研究利用所構(gòu)建的更具生理相關(guān)性的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型評價半枝蓮抗腦膠質(zhì)瘤作用。結(jié)果顯示,2 mg/ml的半枝蓮提取液能降低U251細胞的活力,通過降低線粒體膜電位誘導細胞凋亡,為進一步探究半枝蓮治療腦膠質(zhì)瘤及其作用機制提供實驗基礎(chǔ)。

綜上,本研究采用2D和3D培養(yǎng)方式構(gòu)建了模擬腫瘤微環(huán)境的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型。綜合芯片上細胞活力評價、腫瘤微環(huán)境表征以及兩種抗腫瘤陽性藥物對該模型進行表征并驗證。該模型成功應用于中藥半枝蓮的抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價,闡釋了半枝蓮通過誘導腦膠質(zhì)瘤細胞的凋亡發(fā)揮抗腦膠質(zhì)瘤作用,為中藥抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價、機制研究以及活性成分快速篩選提供研究平臺。

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