透氧熱塑性塑料聚甲基戊烯在長期芯片細胞培養和芯片有機器件中的應用(上)
通過實驗和分析,研究了透氣性熱塑性材料聚甲基戊烯(PMP)在芯片有機物(OoC)和長期芯片細胞培養應用中的適用性。我們使用裝有氧傳感器的密封培養室裝置,測試并比較了PMP與常用的玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。我們發現,與玻璃對照組相比,PMP和PDMS在4天的上皮(A549)細胞培養過程中具有相當的供氧性能,氧氣濃度穩定在16%,而玻璃對照組的氧氣濃度降至3%。首次獲得了生長在PMP上的細胞的透射光圖像,證明PMP的光學特性適用于非熒光活細胞成像。在結合透射光成像和鈣黃綠素AM染色后,A549細胞的細胞粘附、增殖、形態和存活率在PMP和涂有聚-L-賴氨酸的玻璃上顯示相似。與PDMS相比,我們證明了薄至0.125mm的PMP薄膜因其優異的光學性能和機械剛度而與高分辨率共聚焦顯微鏡兼容。PMP還被發現與設備滅菌、細胞固定、細胞通透性和熒光染色完全兼容。我們設想這種材料可以擴展目前最先進的微流體應用范圍,因為它具有有益的物理特性和適用于不同方法的原型制作。這項工作中展示的集成設備和測量方法可以轉移到其他基于細胞的研究和生命科學應用中。
1.導言
片上組織(OoC)是一個快速發展的研究領域,有可能在體外復制人體生理學的關鍵方面,從而成為精準醫學、藥物篩選以及器官功能和疾病病理生理學研究的創新平臺。人們對新型材料和技術的興趣和需求日益增長,這些材料和技術可以在OoC和芯片實驗室平臺中保留天然細胞環境,用于長期細胞培養研究。根據應用需要不同的材料性能組合,這反映在最近報道的用于制造OoC器件的各種不同材料中。這包括彈性體(如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、SU-8聚合物、聚酯彈性體和熱塑性彈性體)、熱塑性塑料(如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、環烯烴共聚物(COC)、聚苯乙烯(PS))、天然聚合物(如膠原蛋白、纖維蛋白、藻酸鹽和透明質酸)、混合材料(如PEG纖維蛋白原和PLA殼聚糖明膠)、粘合劑和環氧樹脂和非化學計量硫烯環氧樹脂(ostemer))、3D打印樹脂(如紫外線固化樹脂、牙科樹脂和水凝膠)和無機材料(如玻璃、硅和陶瓷))。通過整合多種材料和傳感方法,已經投入了許多努力來擴展平臺的功能。然而,由于各種材料限制,這些平臺通常仍會影響細胞實驗,并可能禁止不同實驗室之間直接比較結果。在這項工作中,我們展示了熱塑性材料聚甲基戊烯(PMP)在長期片上細胞培養中的新應用,將其與玻璃和PDMS(片上細胞研究中常用的兩種材料)進行了比較,并為細胞培養設備中的氧氣供應和氧氣監測集成提供了理論和實驗見解。
1.1.培養細胞的氣體和營養供應
在常規細胞培養和在OoC設備內的密閉空間中培養細胞時,持續獲得必要的營養物質和氣體是培養細胞的必要條件。在傳統的細胞培養中,定期更換培養基以輸送營養并去除細胞產生的廢物。同時,分泌的可溶性因子也被去除。氣體供應是通過從周圍空氣通過細胞培養基擴散來提供的,因此是連續的。所有細胞都需要持續的氧氣供應,在用碳酸氫鹽緩沖液配制的培養基中培養的細胞也需要周圍空氣中5%的二氧化碳,以產生7.0-7.4的生理pH值。缺乏適當的氧氣供應會通過激活缺氧誘導因子(HIF)家族的蛋白質對實驗結果產生重大影響,HIF家族可以在低氧條件下重寫細胞轉錄程序。特別是,HIF-1在調節多種細胞過程中起著重要作用,如增殖、凋亡、葡萄糖代謝、蛋白水解等。 .HIF-1目前因其在腫瘤低氧微環境中的細胞存活中的作用而引起了許多研究人員的關注。
1.2.微流體細胞培養裝置中氣體供應的解耦
對于用玻璃等不透氣材料和PMMA、PC、COC和PS等常見熱塑性塑料制成的OoC和細胞培養裝置,培養基的灌注是營養物質和氣體的唯一供應來源,也是去除廢物和分泌的可溶性因子的唯一來源。然而,介質灌注也會對細胞施加顯著的流體剪切應力,導致不希望的細胞類型特異性和剪切應力水平特異性反應。除非正在研究剪切應力本身的影響,否則將灌注流速以及剪切應力保持在盡可能低的水平是有益的。Bunge等人比較了細胞消耗或產生的重要化合物(葡萄糖、乳酸、銨和氧氣),發現氧氣的交換頻率是其他化合物的10倍。因此,氣體供應與介質灌注分離的設備非常有益。此外,從實驗目的本身的角度來看,持續的培養基交換也可能是非常不理想的,因為它還會從細胞附近去除正在研究的未結合化合物(例如細胞因子)。在處理非貼壁細胞、細菌或病毒時,灌注流量也可能存在問題。
1.3.PDMS材料在細胞培養和Ooc設備中的應用
氣體供應的解耦是透氣彈性體材料PDMS如此常用于制造用于細胞培養的微流體裝置的主要原因之一。Bunge等人比較了用于哺乳動物細胞長期培養的微流控裝置,在列出的18個裝置中,有13個裝置的氣體是通過PDMS擴散供應的。其他裝置依賴于用溶解氣體灌注介質,通過水凝膠或開放式儲器擴散。Wu等人回顧了用于體外控制氣體微環境的微流體細胞培養裝置,發現在列出的36個裝置中,有34個至少部分是在PDMS中制造的。
PDMS作為一種研究工具具有一些有利的特性,因為它允許快速廉價的原型制作,易于與玻璃粘合,以及有利的光學特性和可變形性,允許集成片上泵和閥。然而,由于其多孔性和疏水性,它也會吸收小的疏水分子,這會影響疏水性藥物和激素等重要溶質的濃度。其高透水性導致水從PDMS微流體回路中蒸發,并可能導致氣泡形成和滲透壓變化。PDMS的其他特性代表了基于細胞的研究的挑戰,包括未交聯低聚物的浸出,血漿親水化后的疏水性恢復,這限制了保質期,以及高柔量導致微通道變形。此外,很明顯,基于PDMS的設備的大規模生產和商業化受到了擴大規模困難和低制造吞吐量的阻礙。因此,需要確定用于制造透氣OoC器件的新材料。
1.4.用于長期細胞培養研究的PMP材料
作為體外膜肺氧合系統中使用的一種氣體可滲透的熱塑性材料,材料PMP可能是一種很有前途的替代品,能夠在用于長期細胞研究的設備中控制氧氣。PMP,也稱為TPXTM(透明聚合物X),是Mitsui Chemicals,股份有限公司的商標,是一種具有特征分子結構的4-甲基戊烯-1-基烯烴共聚物。分子的低堆積密度導致非常高的氣體滲透性,使PMP與其他幾乎不透氣的熱塑性塑料截然不同。然而,迄今為止,PMP在用于細胞培養和OoC的微流體裝置中幾乎沒有得到探索。
Knoepp等人創建了一個基于PMP的微流體系統,用于同時進行拉曼光譜、膜片鉗電生理學和活細胞成像,以研究單細胞對急性缺氧反應的關鍵細胞事件。該裝置在PMP中研磨,并附著在具有較低玻璃底部的商業細胞培養皿上。在這項工作中選擇PMP是有益的,因為它對目標生物標志物的拉曼光譜幾乎沒有干擾。Ochs等人開發了一種計算模型,用于預測已知透氧性的微流體裝置和具有已知吸氧行為的細胞類型中的氧氣水平。該模型是使用微流體結構通過實驗確定的,這些微流體結構要么是在COC或PMP中注塑成型的,要么是在PDMS中成型的,這些結構附著在商業氧傳感器箔上。當貼壁細胞在傳感器箔上生長時,監測設備內的氧氣水平兩個小時。盡管這些研究顯示了有希望的結果,但關于PMP在長期細胞培養設備中的使用,還有很多研究要做,例如在細胞培養的幾天內進行氧氣監測,以及在設備內PMP材料本身上培養和成像貼壁細胞。在Knoepp等人和Ochs等人[23]的先前工作中,裝置的細胞粘附部分是由其他材料制成的。
在這里,我們對用于長期芯片細胞培養和OoC應用的設備的PMP材料的性能進行了研究。評估包括與玻璃相比的細胞粘附、增殖和形態的調查,細胞透射光和熒光共聚焦顯微鏡的適用性,與常見化學物質的相容性,設備制造以及在沒有灌注的情況下在密封設備中培養4天的細胞供氧氣體滲透性。為了評估PMP在這種環境下的透氣性能,我們開發了一種帶有隔離、封閉培養室的設備,該培養室裝有氧氣傳感器,可以直接比較PMP和對照材料玻璃和PDMS(圖1)。封閉的、氧氣監測的培養室充當模塊,通過將培養室、合適的微流體通道網絡和芯片到世界的接口組合在一個單一的設計中,可以用作形成復雜的OoC甚至具有受控氧氣環境的片上身體設備的構建塊。
原型制作方法(即銑削)和適用于大規模制造的技術,如注塑都適用于PMP。這對于這種材料在醫學和制藥研究以及商業應用中的可重復性來說是一個很大的優勢。這項工作的目的是證明PMP在長期微流體細胞培養設備中的潛力,并為對熱塑性塑料基透氧細胞培養設備感興趣的學術和工業界提供一種替代方案。
2.材料和方法
2.1.細胞和培養條件
A549細胞最初購自美國典型培養物保藏中心。它們在添加了10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素抗生素溶液的F12K培養基中培養。細胞在標準條件下(37°C,5%CO2)在ThermoFisher系列8000 WJ培養箱中培養,達到90%融合后每2-3天傳代一次。
2.2.培養箱裝置的設計與制作
2.2.1.集成氧傳感器培養箱裝置的設計
培養室的設計是為了測試PMP的適用性,而不會因不必要的設計復雜性而影響實驗結果。圖2所示的設備用于氧氣測量(第2.3節)和Hif1α染色。每個裝置由一個容納細胞培養室的基板(圖2中從頂部起的第二層)和一個蓋子(頂層)組成,兩者都在PC中研磨。每個基板都有兩個腔室,用于實驗中的技術復制。設計了三種不同的設備變體,在基板下方集成了不同的材料,以獲得PMP實驗的充分控制:(1)帶有PMP薄膜的設備(“傳感器/PMP”)(圖2a);(2)帶玻璃蓋玻片的裝置(“傳感器/玻璃”)(圖2b);以及(3)帶有PDMS薄膜的設備(“傳感器/PDMS”)(圖2c)。腔室直徑為6.4 mm,與常規96孔板中的孔直徑相似,高度為4 mm。蓋子的設計符合基板的輪廓,一個圓形腔體(內徑10 mm,外徑13.6 mm,深度1.2 mm)用于插入10×1.5 mm2的硅膠O型圈(Otto Olsen,Skedsmokorset,Norway),確保了用螺釘固定時基板和蓋子之間的緊密密封。使用硅膠Dowsil SG2 734將直徑為3 mm的氧敏感點SP-PSt3-NAU-D3-YOP粘到蓋子上,將其定位在組裝好的裝置中腔室的頂部中心。位于氧傳感器點上方1毫米處的圓形插座設計用于容納光纖,以讀取敏感點的信號。對于PDMS,除了PSA外,還使用了在PC中銑削的支撐夾板,如圖2c所示。PSA和PDMS之間的粘合強度不夠,因此需要額外的機械夾緊。
2.2.2.無氧傳感器培養箱裝置的設計
為了比較PMP膜和玻璃蓋玻片上的細胞粘附、增殖和存活率,使用了圖3所示的裝置。與第2.2.1節所述裝置的唯一區別是蓋子,蓋子在這里僅作為支撐蓋,以確保無菌。這些設備將被稱為“非傳感器/PMP”和“非傳感器/玻璃”。
2.2.3.制造
使用三軸銑床在聚碳酸酯(Lexan)中銑削基板、蓋子和夾板。用異丙醇擦拭研磨后的零件,在去離子水中漂洗,并在去離子水中超聲處理5分鐘。然后將氧敏感點粘在蓋子上,在室溫下干燥24小時。然后,在空氣中對18個傳感器進行了表征,發現平均氧濃度為21.5%,標準偏差為0.03%。厚度為0.125mm、等級為DX845的商用PMP薄膜ME31110通過首先用粒徑為3μM、然后為1μM的金剛石拋光劑、DP懸浮液拋光,使其光學透明,并在去離子水中超聲沖洗。使用PSA將玻璃蓋玻片或PMP膜附著在基板上,使用PSA和夾板將PDMS膜附著在基板。
2.2.4.不同滅菌方法的兼容性測試
PMP薄膜暴露于以下滅菌化學品:Aerodesin 2000、70%乙醇和100%甲醇。對于物理滅菌,PMP薄膜在121°C的高壓釜中暴露于蒸汽滅菌20分鐘,在層流柜中暴露于紫外線30分鐘或等離子體處理。使用配備有13.56 MHz/50 W發生器的低壓等離子體清潔器進行等離子體處理,步驟如下:(1)將工作室中的空氣抽空,并將壓力降至0.1毫巴,(2)向工作室供應氧氣(5分鐘,流量10sccm),以及(3)運行等離子體處理過程(50 W,5分鐘),保持氧氣流量為10sccm。
免責聲明:文章來源https://doi.org/10.3390/mi14030532 以傳播知識、有益學習和研究為宗旨。轉載僅供參考學習及傳遞有用信息,版權歸原作者所有,如侵犯權益,請聯系刪除。
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