2.3 電場流動分離技術

場流分離技術最早由Giddings等發明,是分析分離領域用來分離大分子膠體和顆粒材料的一種分離方法,隨著場流分離技術的不斷發展,其也逐漸成為色譜分離體系中一項重要的分離技術。其中電場場流分離技術被越來越多的研究學者使用,其分離原理是通過在分離通道的上下壁(電極)所施加的直流電場或交流電場,對混合帶電顆粒進行精準分離。該技術可以根據混合樣品的大小與帶電性質的不同進行分離和聚焦等處理,如圖1c所示。傳統的直流電場流分離技術是針對通道壁施加固定電壓,通道壁表面在直流電場條件下形成雙電層,降低通道內有效電場,導致電場場流分離技術的分離效率大大降低。在交流電場流分離技術中,施加的交流電場根據頻率調節電場方向,減緩內電極表面形成的雙電層,提高通道內有效電場,起到提高分離效率的作用。目前電場場流分離技術可以對顆粒物、生物細胞和外泌體等進行有效分離,被廣泛應用于微納米顆粒和細胞分離等領域。Tasci等為了改善納米顆粒在交流電場場流分離中存在的小尺寸微納尺度物質的擴散現象,對電參數中的偏置電壓進行調節。該團隊使用高于50%的偏置電壓對50 nm以下顆粒物進行有效分離,結果證明通過調節偏置電壓可以減小擴散現象對分離納米顆粒的影響,提高分離效率。Petersen等利用交流電場場流分離技術對外泌體的分離進行研究,以交流電壓為常量,流動相為變量的條件下對外泌體進行了分離,證實交流電場流分離技術可以對外泌體進行有效分離。

在電場場流分離技術中,電極容易產生電極極化的現象,限制了電場場流分離技術在微流控芯片中的應用。對此,本課題組提出了微顆粒分離“靶式分布”新概念毛細管靶式電場流分離技術,如圖4所示。利用離子液體及介孔硅材料界面修飾技術解決了電極極化的問題,實現了在環形通道中對微納尺度物質的在線分離。通過微流控芯片模擬該體系下顆粒物的運動情況,成功分離不同尺寸的聚苯乙烯顆粒物。該技術解決了傳統電場流分離領域中電極極化的問題,并提出了顆粒物的靶式分布和錐形排列新理念,在單細胞分離分析、外泌體分離等具有廣闊的應用前景。

圖4   開管式毛細管電場流微分離技術原理示意圖

2.4 電滲分離

感應電荷電滲是導體表面與電場相互作用產生的雙電層的擴散層在切向電場作用下產生微旋渦的一種電化學效應。在電場條件下電極表面發生極化現象形成雙電層,雙電層分為致密層與擴散層,其中擴散層在電場作用下發生移動,致密層中離子不動,進而在電場內形成渦旋,混合樣品中不同帶電特性的樣品將會隨著渦旋逐漸向懸浮電極中心移動,根據不同的運動行為,達到分離作用,如圖1d所示。基于ICEO的顆粒分離方法具有可調節流型、操作方便、無接觸等優點。

Chen等提出了一種利用誘導電荷電滲透在連續流體中分離顆粒的微流控芯片裝置,如圖5所示。利用ICEO產生渦旋成功對聚苯乙烯顆粒與二氧化硅微粒顆粒物進行分離,分離效率在99%以上。ICEO對酵母細胞的純化回收率超過96%。感應電荷電滲透技術在與微流控技術聯用后,可以針對不同樣品進行聚焦、分離和純化等實驗,為今后生物、醫療和化學領域的微納尺度物質分離提供一種有效技術支撐。

圖5   基于誘導電荷電滲透的微流控分離系統

綜上描述,電場分離技術的無標記分離、高選擇性以及高效分離等特點和微流控裝置樣品量少、金屬污染少、樣品制備簡單等特性的結合大大提高了對生物細胞和微納米顆粒的精準分離、捕獲及聚焦等效果。在微納尺度物質分離領域中具有良好的應用前景。

3 基于外加磁場的分離技術

近年來,利用外加磁場的作用操縱微顆粒、細胞等微納米尺度物質分離分析逐漸被重視起來。磁場分離技術中磁性納米顆粒與目標物可以簡單有效的結合,磁場條件下可以對包裹磁性納米顆粒的樣品實現溫和、無損和高通量的快速分離,因此在分離微納尺度物質研究中成為最佳選擇之一。同時,在微流控體系下采用磁珠分離方法對微納尺度物質進行分離也已非常普遍。越來越多的研究學者將磁場分離技術與微流控技術進行聯用,在微流控體系下的磁場分離技術利用磁性顆粒修飾的抗體或官能團,與所需的細胞或蛋白質進行特異性結合,在不同磁場條件下微流控連續分離裝置可以分離不同類型的微尺度混合物,利用磁場與微流控技術的耦合裝置可以分離磁性顆粒與非磁性顆粒,以及帶有不同性質的磁性顆粒物。所以利用磁場分離技術與微流控裝置結構進行聯用受到國內外研究者的廣泛關注。Kumar等開發了一種新型的微流控裝置,該裝置采用永磁體,在0.5~5 mL/h流速范圍內研究了11個聚氰胺微粒子對薄微通道壁的無鞘液磁性聚焦。將順磁性粒子的混合物注入該裝置以演示其分選原理。兩種不同尺寸的混合磁粒子均沿通道壁排列,在設備前半段達到聚焦,不同尺寸大小目標物位于不同的流線上,在進入膨脹區域時,被分割成明顯的流線以達到分離的效果。通過磁場場流分離與微流控裝置的聯用,達到了高通量(10000 cells/s)和高純度(98%)的效果。該方法克服了傳統磁泳法操作復雜、準備和操作時間長等局限性,將磁場分離技術與微流控技術進行聯用,從而對不同尺寸、不同磁性的微納米顆粒和生物細胞進行分離分析。

Pamme等利用特定的微流控裝置對磁性納米顆粒和非磁性納米顆粒進行連續流動分離,如圖6a所示。通過將混合樣品注入裝置內的分離室,顆粒物在受到垂直向上的磁力作用下,根據顆粒物自身磁化率和大小等性質不同,在不同的層流方向上產生偏轉達到分離的效果。利用微流控分離通道設計性強的優點,可以根據混合樣品的磁性不同來調節磁鐵的具體位置,達到精確分離的效果,分離后的目標物在微流控裝置的不同出口處流出,進入到不同的緩沖層,在下游對其進行多步生化處理,為后續實驗做準備。

圖6   基于磁場的微流控分離系統

Malica等以食源性病原體引起的人體感染疾病問題作為出發點,針對單核細胞增生李斯特菌引起的感染對衛生安全構成威脅等問題進行研究,提出了利用磁性納米粒子對其進行免疫磁分離。根據它可以有效對目標細胞進行捕獲的優點,與微流控技術耦合制作了一個磁場-微流控芯片裝置,如圖6b所示,該裝置的磁捕獲區由多個涂覆了軟鐵磁鎳的圓柱組成,可以產生強大可切換的三維磁陷阱,并利用數值和相關理論分析預測磁陷阱周圍的磁場分布,對磁標記的細菌進行高效磁捕獲和釋放,具有靈活、可定制、低成本等特點,還可以針對各種微米以及亞微米級別目標物分離捕獲,對MNPs的最大回收率為91%,活菌的最大捕獲效率為30%。該微流控裝置可以對食品安全細菌檢測提供技術支持。

Moser等提出了一種在芯片上捕獲蛋白質的磁珠免疫凝集方法,如圖6c所示,該方法利用垂直在流動方向上的磁力,使磁性顆粒固定凝集在通道壁上,而磁場梯度的周期性翻轉和力場的變化使磁珠在通道內不停地做循環運動,形成更大的磁粒子動態塞,用來捕獲流動相中的目標物,并用簡單的光學檢測方法確定免疫凝集的磁珠量以及濃度,為芯片上蛋白質捕獲領域提供了一個更加有效的技術支持。

Ungerbock等對磁光傳感器粒子在微流控裝置中的實用性進行了評價,如圖6d所示。MOSePs可以用于任何帶有光學透明微流控芯片的微觀氧氣成像、多重分析物的并行監測和作為靈活的傳感器點監測酶活性,當無法集成傳感器層時,也可以在微流控結構中形成固定傳感器點。以氧傳感器為例,Ungerbock等研究了不同直徑的MOSePs的積累特性以及在不同流速下原位傳感器的穩定性,利用馬高列斯熒光黃色染料(MFY)和路瑪近紅色染料(LR)對磁光傳感粒子進行染色,再從外部使用磁鐵裝置對其進行分離。實驗結果證明,MoSePs作為微流控器件中的一部分,促進發光傳感器領域的進一步集成。

綜上所述,磁場的無標記特性與微流控技術的聯用,在微流控芯片裝置內部將微納尺度物質根據自身性質(大小、磁化率)的不同,實現對微納米顆粒的在線連續分離,達到對目標樣品的快速、無損和高效分離和捕獲。

4 基于外加聲場的分離技術

在微納米尺度下如何實現微顆粒的精準操縱一直是研究的熱門。研究發現,施加外場的方式可以實現對微顆粒的操縱,其中運用聲場的方式相較于其他外場來說所需能量更小,不會損壞細胞等微納尺度物質活性和對樣品電性和磁性等無特殊要求,因此適用面更為廣泛。聲場分離技術是指在微流體系統中利用聲輻射力操縱懸浮液中的微納尺度物質分離的一種技術。ARF的表現形式可以分為體聲波或表面聲波。SAW更容易通過增加頻率來調節粒子運動速度,從而操縱粒子的運動,甚至可以驅動流動相。另外,在1988年,Semyonov等首次提出聲場場流分離技術。它可以將液體內部的膠體顆粒、蛋白質和細胞等物質進行聚焦分離處理,利用聲輻射力作為驅動流動相中混合顆粒物的外力,根據混合樣品中各個微粒的大小、尺寸和密度等性質所產生的運動行為在微流控芯片裝置中起到分離作用,以及利用小尺寸顆粒物在流動相中的擴散起到抑制的作用,達到精準分離和聚焦的效果,目前廣泛應用于細胞篩選、細胞捕獲和生物聚合物分離等。體聲波微流控芯片可以利用駐波的聲泳力來提高吞吐量,也可以對顆粒物進行聚焦。這兩種方法具有細胞損害小、保持細胞完整性和裝置便捷的優點。Hwang等研制了一種聲場場流分離裝置,在特定的微流控裝置的通道中,沿重力方向上釋放超聲波駐波并在通道底部形成一個壓力節點。同一方向的聲場力和重力對小尺寸混合顆粒物起到抑制擴散的作用。通過熒光顯微鏡的檢測觀察,該微流控裝置成功對1.0、3.5和10 μm的混合熒光顆粒物進行了有效分離。

Jakobsson等提出了一種利用超聲波駐波在微流控通道內部對紅細胞進行聚焦和控制的方法,如圖7a所示。紅細胞可以用來檢測生物細胞的生理狀態,但是細胞在流動相中面向激光光源的橫截面位置不同,因此相同細胞所處不同的橫截面時可能檢測出不同的光散射測量值,所以控制紅細胞的定向能力對生物醫療分離是有必要的。該團隊利用聲波對細胞無損害、靈敏性強的特點在微流控芯片中利用駐波聲場將紅細胞的橫截面最小的尺寸方向與聲場方向平行。結果表明,有87.8%±3.8%的紅細胞可以水平定向,有98.7%±0.3%的紅細胞可以垂直定向。該技術對快速發展的流式細胞計數和圖像細胞計數都有潛在貢獻。

圖7   基于聲場的微流控分離系統

Li等發現從癌癥患者的臨床樣品中篩選循環腫瘤細胞存在技術限制、吞吐量不足和缺乏設備長期穩定性等問題,選擇利用聲場力無標簽和無接觸分選的優點并結合微流控裝置高吞吐量的優勢制作了一種傾斜角站立表面聲波微流控裝置,如圖7b所示。該裝置可以在流速為20 μL/min的條件下將循環腫瘤細胞從白細胞中進行有效分離,并且針對癌細胞的回收率可以達到83%~96%,白細胞的去除率達到99%。這種方法適用于分離和白細胞有顯著大小和密度差異的癌細胞,利用傾斜角度的駐表面聲波裝置對臨床樣本進行高通量分離,從白細胞中分離罕見癌細胞的效率比以往技術具有更高的分離性能,并適用于細胞清洗、細胞同步、血液成分分離和細菌分離等。

Ahmed等制作了一種傾斜角度的表面聲波的無鞘液聚焦和連續流中的粒子分離裝置,如圖7c所示,利用兩個互相交叉傳感器產生與流動方向呈30°的高頻傾斜角度表面聲波,在不使用鞘液的條件下直接對粒子施加聲輻力,分別在194 MHz和136 MHz頻率下通過IDTs的激發,粒子被連續聚焦在微通道壁面的一側,在流速為83.3 mm/s下,taTSAW微流控裝置對4.8 μm和3.2 μm顆粒的樣品混合物聚焦并分離,分離純度高達99%。在兩個微流控通道出口處顆粒分離率分別為93%和100%。這種方法較其他分離技術相比,不需要額外的鞘層流來進行聚焦處理,在生物和生物醫學領域具有潛在的應用價值。

聲場也可以對目標物進行聚焦處理,例如Liu等利用簡單低成本的環形壓電傳感器制作了一種有壓電環陣列組成的聲流控多孔板微流控裝置,用于在每個板中心快速富集微納尺度物質,如圖7d所示,在玻璃基板上的圓形駐波產生向內的徑向聲流,誘使微納尺度物質在聲場力的帶動下將每個孔中的微納尺度物質進行富集。實驗結果證實,在0.4~30 μm范圍內均可進行操縱且具有良好富集效果。具有低成本、低功耗、簡單和可控性強等優點,可以在生物和醫療等領域成為強大的工具。

Shi等利用駐波表面聲波聚焦技術在軟光刻法制備的聚二甲基硅氧烷通道上進行聚焦實驗。如圖7e所示,樣品在壓力驅動力作用下注入微流控通道內,受到兩組在懸浮液中相同且延相反方向傳播的表面聲波形成駐聲表面波(SSAWs),通過調節兩個IDT釋放的波長控制SSAWs的壓力節點和反壓力節點位置,進而控制其在流體中的周期性壓力節點(最小壓力)和反正壓力節點(最大壓力),當通道僅覆蓋一個壓力節點時,樣品受聲場影響在中心線處聚焦,由于不同尺寸顆粒物在通道內的運動距離不同,較大尺寸顆粒物比較小尺寸顆粒物有更大的橫向位移,該裝置對0.87 μm和4.17 μm的乳膠粒子在360 ms內進行了分離。該方法具有操作簡單、快速便捷等優勢,幾乎可用于任何微粒的聚焦。

綜上所述,聲泳分離技術作為與生物樣品非接觸的分離方式,在分離生物細胞時具有不破壞生物樣品性的優勢。將聲泳分離技術與微流控技術進行聯用可以彌補傳統聲泳技術裝置龐大、操作復雜和對尺寸差異較小的顆粒分辨率低等缺點,從而達到高通量、無損害和操作簡單的分離效果,為單細胞分離和捕獲等領域提供重要的技術支持。

5 總結與展望

利用流動場、電場、磁場和聲場等主動場分離技術與微流控技術的聯用,可以提高在不同條件下對微納尺度物質的分離與富集能力。本文綜述了4種外加場在微流控技術中的研究進展以及在未來的發展趨勢,流場場流分離技術利用溫和分離的特性,成功對蛋白質和DNA等物質進行分離,并與其他檢測器耦合,對不同樣品表征精細化和對生物細胞的分離具有重要意義。在基于電場分離的微流控技術中因物質本身或外部環境影響使其具有帶電特性,所以基于電場的微流控技術應用比較廣泛,且可實現對微納尺度物質的無標簽、高選擇性和高效分離;基于磁場的微流控技術對物質本身磁性要求更為嚴格,且部分需要對目標物進行標記,難以實現無損分離,因此對分離分析較為脆弱的生物細胞存在限制;將聲場和微流控技術聯用的裝置可以利用聲場力對細胞進行精準操控,實現目標物無損傷、高通量、快速的分離。利用主動場分離技術選擇性好、分離度高等優點,結合微流控技術的具有微型化、集成化、成本低廉等優勢,達到使復雜分析方案合理化,顯著減少樣品體積和試劑成本,在處理微量樣品時具有快速化學分析、高吞吐量和高分辨率的效果,對生物樣品的富集濃縮都有較大的研究前景和價值。從應用方面來看,利用微流控芯片實現微納尺度物質的分離是社會發展的必然趨勢,但由于外加場裝置普遍都需要復雜龐大的驅動裝置,所以實現整個系統的微型化、便捷化仍是迫切的應用需求。隨著相關技術的不斷發展和進步,未來將會真正實現微型化、集成化的微流控主動場分離技術應用于癌細胞的篩選、癌癥的早期檢測、微尺度物質的精準分離等各個方面。

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