藥物篩選是新藥研發的關鍵步驟,創新藥物的發現需要采用適當的藥物作用靶點對大量化合物樣品進行篩選。高通量篩選系統能夠實現數千個反應同時測試和分析,大大提高了藥物篩選的實驗規模和效率。其中基于細胞水平的高通量藥物篩選系統因為更加接近人體生理條件,成為主要的篩選模式。而目前發展成熟的高通量細胞篩選系統主要基于多孔板,存在細胞培養條件單一、耗時費力、試劑消耗量大等問題,且較難實現復雜的組合藥物篩選。微流控技術作為一種在微米尺度通道中操縱和控制微流體的技術,具有微量、高效、高通量和自動化的優點,能較好地克服多孔板篩選系統的不足,為構建細胞高通量藥物篩選系統提供了一種高效、可靠的技術手段。微流控系統在細胞培養材料、芯片結構設計和流體控制方面均可靈活變化,能更好地實現對細胞生長微環境的調控和模擬。文章綜述了基于微流控技術的細胞水平高通量藥物篩選系統的研究進展,按照不同的微流體操控模式,對基于灌注流、液滴和微陣列的3種類型的微流控細胞篩選系統進行了分類介紹,并分別總結了它們的優缺點,最后展望了微流控細胞水平高通量藥物篩選系統的發展前景,提出了該領域目前存在的問題以及解決問題的方向。

藥物篩選是指從天然產物或者人工合成的化合物中篩選出具有生物活性的新藥或者先導化合物,是新藥研發過程中的關鍵步驟。創新藥物的發現需要采用適當的藥物作用靶點對大量化合物樣品進行篩選。而隨著基因組學、蛋白質組學、代謝組學、組合化學等學科的發展,藥物分子庫在不斷擴大,藥物作用靶點也越來越多,這使得藥物發現的范圍逐漸擴大,藥物篩選的工作量急劇增加。因此高通量篩選(high-throughput screening)技術應運而生。高通量篩選系統以分子水平或細胞水平的實驗方法為基礎,通過自動化操作系統、靈敏快速的檢測系統和數據分析系統能夠實現數千個反應同時測試和分析,大大提高了藥物篩選的實驗規模和效率。基于細胞水平的藥物篩選系統因為更加接近人體生理條件,實驗準確率更高,成為主要的篩選模型。

目前已經發展成熟的細胞高通量篩選系統主要是基于多孔板進行的。它們利用自動化的液體轉移分配機械臂完成對液體的多步操控和試劑運輸,并使用多孔板掃描儀或者自動化顯微鏡掃描拍攝技術對細胞的生存情況進行檢測。但是這些自動化設備的價格相對較高,不利于普通小型的研究中心或實驗室使用。另外,用于藥物篩選的生物樣品和藥物庫的成本也較高,而目前常規液體處理設備能夠準確操控的液體體積在數百納升水平。

微流控技術是近年來的研究熱點之一,其核心是將常規化學、生物等領域所涉及的基本操作單元集成到方寸大小的芯片上,實現對nL級至pL級液體的精準操控,在化學、生物學、醫學等領域都具有廣泛的應用。利用微流控技術可以構建高通量、低成本細胞水平的藥物篩選系統,系統具有樣品及試劑消耗量少、系統高度集成化和自動化等優點。同時,微流控芯片與傳統的細胞培養器皿相比,在細胞培養上也具有諸多優勢。如通過選擇不同的芯片材料或者設計不同的細胞培養腔室結構,更容易實現細胞的三維(3D)培養。因此,基于微流控技術的細胞篩選系統是一種極具潛力的藥物篩選系統。

在微流控細胞篩選系統中,通常會涉及細胞的接種、培養液的更換或添加、藥物的加入與清洗、細胞染色試劑的添加等操作,這些操作均需通過對微流體的操控得以實現。按照微流體操控模式的不同,可將微流控細胞篩選系統分為3類,分別是灌注流模式、液滴模式和微陣列模式。

基于灌注流模式的微流控細胞篩選系統

基于灌注流模式的微流控細胞篩選系統,通過控制流體連續流過微通道,將細胞接種在微通道中的細胞培養腔室,并完成對細胞的藥物刺激。流體的驅動力主要有外部機械泵驅動、電滲驅動、重力驅動以及表面張力驅動等方式。這類系統的優勢在于容易實施,并適用于不同的細胞檢測方法,如熒光檢測、吸光度檢測、電化學傳感器實時檢測,以及通過質譜對細胞代謝物或其他生物標志物進行檢測。這類系統的局限性主要有:利用微通道進行連續流體輸送易導致較高的試劑消耗;當被應用于大規模的藥物篩選時,芯片結構通常比較復雜,涉及多種通道、液體控制泵和閥門的設計。

Wang等設計了一種基于灌注流模式的微流控芯片,用于正交化的藥物篩選(見圖1a)。芯片在水平和垂直兩個方向上分別加工有24條通道,通過在芯片中集成氣動彈性微閥實現對垂直通道和水平通道的分別控制,完成不同類型的細胞接種和不同藥物對不同細胞的正交化刺激。利用該芯片測試了洋地黃皂苷(digitonin)、皂角苷(saponin)、丙烯醛(acrolein)、氯化鈷(CoCl2)和氯化鎳(NiCl2)5種物質分別對于小鼠胚胎成纖維細胞(BALB/3T3)、HeLa細胞和牛內皮細胞(bovine endothelial cells)的毒性作用,實現了高密度平行的藥物篩選。Park等在類似的芯片結構上設計了橋連式的微通道來輸送細胞和藥物(見圖1b),研究了細胞外基質與可溶性轉化生長因子-β1對二型肺泡上皮細胞(ATII)表型的影響。這種方法不僅可以提高對目標細胞腔室尋址的靈活性,還能減少流體剪切力對細胞的影響。

圖 1   基于灌注流模式的微流控細胞篩選系統

顯著的層流效應是灌注流體系的主要特征之一,利用該效應可以在微通道內形成具有較高重現性和穩定性濃度梯度的液流,這類系統被廣泛應用于細胞高通量藥物篩選中。Ye等將濃度梯度藥物形成與細胞培養這兩個單元集成到一個圓盤芯片中(見圖1c)。該芯片含8個具有相同結構的單元,每個單元在上游包含一個“圣誕樹”結構的濃度梯度生成器,下游平行連接多個細胞培養腔室,單次可產生64種藥物作用條件,實現了對阿霉素(doxorubicin)誘導肝癌細胞(HepG2)凋亡過程的監測。An等將兩個相似結構的濃度梯度生成器與細胞培養腔室正交連接,評估了姜黃素(curcumin)和腫瘤壞死因子-α相關誘導凋亡配體對前列腺癌細胞(PC3)的聯合治療效果。

為了擴大藥物濃度梯度范圍,Zhang等設計了一種非對稱流體通道結構的濃度梯度生成器,用于生成具有對數級濃度混合比的藥物組合。3D打印技術由于能夠制造結構復雜且相互連接的微流體通道,因而被用來加工用于溶液混合的微流控芯片。Chen等利用3D打印得到了具有三維立體螺旋結構的濃度梯度生成器(見圖1d),并測試了4種藥物的36種濃度組合對肺癌細胞(A549)的抑制作用。

基于微通道表面的二維(2D)細胞培養模式缺乏細胞生長分化所需的多層次微環境,例如細胞和細胞之間以及細胞和基質之間的相互作用,這可能會導致篩選得到的藥物在被應用到臨床試驗時,治療效果產生較大偏差。3D細胞培養模式因為可以提供更加接近體內條件的微環境,而吸引了越來越多研究人員的關注。如圖2a所示,Patra等通過對聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片進行預處理,使細胞不能貼壁生長,從而在腔室中形成細胞球并進行藥物刺激。該研究組研究了順鉑(cisplatin)、白藜蘆醇(resveratrol)和替拉扎明(tirapazamine)3種藥物對不同大小的HepG2細胞球的影響。實驗結果表明,細胞球的大小和細胞的培養模式(2D和3D)對藥物刺激結果均有明顯的影響。Toh等報道了一種基于3D肝細胞培養的微流控芯片系統(見圖2b)。通過在芯片的通道中央加工兩排并列的微柱陣列來固定肝細胞,維持肝細胞的3D形態和代謝功能,之后由兩側平行通道引入不同的藥物刺激肝細胞,實現對肝細胞的高通量藥物毒性測試。Mulholland等發展了一種微流控平臺,該平臺直接利用腫瘤活檢中獲得的富含癌細胞的多細胞球體進行藥物篩選,能夠提高篩選結果的準確性。Pandya等將電化學傳感器集成到微流控細胞篩選系統中,通過叉指微電極實時檢測3D凝膠基質中植入的癌細胞對不同藥物的敏感性(見圖2c)。這些數據可以潛在地預測患者對于不同化療方法的反應,從而選擇出最佳治療手段,改善癌癥治療效果。

圖 2   基于3D細胞培養的灌注流模式微流控細胞篩選系統

隨著微流控技術的不斷發展,多種能夠用于模擬人體不同器官及組織間相互作用的器官芯片(organ-on-a-chip)系統已經被報道,包括肺芯片、腎芯片、腦芯片和腸-肝-腫瘤芯片等。這些器官芯片系統大部分是基于灌注流模式構建。Huh等構建了一種具有一定仿生功能的肺芯片(見圖3a)。該芯片中,在上下兩個PDMS通道之間加工有PDMS多孔膜,PDMS多孔膜上下兩側分別接種肺泡上皮細胞和內皮細胞,肺泡上皮細胞暴露在空氣中模擬肺泡的空隙,培養基從下方通道注入模擬毛細血管,通過循環施加真空帶動膜的往復運動模擬肺的呼吸。該研究組將白細胞介素-2(interleukin-2)添加到培養基中,再現了其導致肺水腫的藥物毒性,并觀察到血管生成素-1(angiopoietin-1)以及一種新的香草酸受體4的離子通道抑制劑(GSK2193874)能抑制其藥物毒性。Liu等設計了一種微通道芯片用于模擬腫瘤誘導的血管生成(見圖3b)。芯片包含6個獨立的血管生成單元,每個單元由一個開放式的細胞培養腔室和腔室兩側的血管生成通道組成。通過觀察內皮細胞在腫瘤細胞誘導下的遷移和血管生成過程,研究了不同的抗血管生成試劑對內皮細胞遷移的抑制作用。Oleaga等構建了一種包含心臟、肌肉、神經元和肝臟細胞的多器官芯片(見圖3c)。通過重力驅動培養基在不同細胞腔室之間循環流動,實現對細胞的動態培養和藥物刺激過程。在芯片上測試了5種藥物的細胞毒性,得到的結果與已被公布的動物實驗毒性結果基本一致。

圖 3   基于灌注流模式的器官芯片系統

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