微型化是現代分析儀器發展的重要趨勢。微型化液相色譜儀器在提供與常規尺度液相色譜相同甚至更高分離效率的同時,可以有效減少溶劑和樣品的消耗;在液相色譜-質譜聯用中,低流速進樣可以有效提高質譜離子源的離子化效率,提高質譜檢測效率;對于極微量樣品的分離,微型化的液相色譜可以有效減少樣品稀釋;液相色譜的微型化還有利于液相色譜儀器整體的模塊化和集成化設計。芯片液相色譜是在微流控芯片上制備色譜柱并集成相應的流體控制系統和檢測系統。芯片液相色譜是色譜儀器微型化的一種重要方式,受到學術界和產業界的普遍關注,但是這一方式也充滿挑戰。液相色譜微流控芯片需要在芯片基底材料、芯片色譜柱的結構設計、微流體控制技術、檢測器技術等方面做出創新,使微流控芯片系統適配液相色譜分離技術的需要。目前芯片液相色譜領域面臨的主要問題在于芯片基底材料的性質難以滿足芯片液相色譜進一步微型化和集成化的需求;因此芯片液相色譜在未來的發展中需要著重關注新型微流控芯片基底材料的開發以及微流控芯片通道結構的統一設計。該文著重介紹了芯片液相色譜技術近年來的研究進展,并簡要展示了商品化芯片色譜當前的發展情況。

微型化已成為現代分析儀器發展的一個重要趨勢。微型化的分析系統可以有效地減少樣品和試劑的消耗,提高檢測效率,降低檢測成本。作為重要的分離分析手段,色譜儀器的微型化也是分離科學未來發展的重要趨勢。從色譜儀器的角度看,微型化可以帶來的優勢包括: (1)溶劑消耗量的大幅減少,理想狀態下相較于常規色譜系統可減少溶劑消耗近3個數量級;(2)樣品需求量下降,適合生物組學研究等無法獲得大量樣品的分析領域;(3)快速的分離分析;(4)有利于色譜裝置的模塊化、集成化設計。此外,在液相色譜-質譜聯用中,由于電噴霧離子源(ESI)的離子化效率與前端色譜流速的倒數具有線性關系,色譜微型化帶來的低流速可以有效適配ESI-MS,適用于分析生物組學研究中常見的微量復雜樣品。

基于微流控芯片平臺的液相色譜被稱為芯片液相色譜。得益于微機電技術(MEMS)強大的微結構加工能力,相較于另一類微型化色譜——毛細管液相色譜,芯片液相色譜具有更高的靈活度和可集成性,在微型化、模塊化、智能化、自動化等方面,芯片液相色譜具有更好的發展前景。目前,芯片液相色譜可以良好地實現常規液相色譜的富集、分離等功能,產業界也在芯片液相色譜商品化上取得一定成果。本文將著重介紹近年來芯片液相色譜技術在學術界和產業界的最新進展,并展望芯片液相色譜技術未來的發展方向。

1 芯片色譜系統

芯片色譜系統的設計、加工、使用是一個復雜的系統工程。根據具體分離任務的需要,芯片基底材料的選擇、色譜固定相的選擇、芯片通道結構的設計與制造、流體驅動方式以及芯片連接方式的選擇、檢測器的選擇與聯用、特殊色譜結構或方法的聯用,各個要素相互影響、相互牽制,每一個要素都具有重要的作用。

1.1 芯片基底材料

芯片基底材料的選擇需要綜合考慮材料的特性(硬度、形變模量、化學惰性、吸光性質、吸脫附性質、生物兼容性等),并根據所擁有的加工手段以及分離分析的具體條件來決定。最早使用的芯片色譜基底材料是硅。由于早期微流控芯片加工工藝大部分直接繼承自微機電加工技術,硅自然成為工程師們最為熟悉的芯片材料。硅材料具有較高的硬度和良好的化學惰性,適用于絕大多數色譜方法,因此硅在早期芯片液相色譜領域內有很多應用。但是,硅在紫外以及可見光區無法透射,這導致在硅芯片上直接原位使用光學檢測較為困難。因此,人們常用玻璃或石英材料替換硅。玻璃以及石英具有出色的化學穩定性、機械強度、優良的生物兼容性和可衍生能力,同時還具有極高的透射率。Belder課題組在玻璃芯片上開展了系統性的工作。他們設計了一整套標準化的玻璃芯片器件(見圖1a),這些芯片結合了液相色譜分離與ESI離子源,并配備了高壓不銹鋼夾具用于芯片與外部設備的連接。這種高壓不銹鋼夾具可以承受高達36 MPa的流體壓力,同時還可以實現極低死體積(約2~10 nL)的側向芯片連接。Mellors等設計了一種毛細管電泳芯片并與ESI-MS聯用,他們將矩形芯片的一個角直接作為ESI噴口,證明了玻璃芯片可以直接作為ESI離子源的噴口。利用玻璃對高溫的耐受性,Heiland等開發了具有溫度梯度洗脫功能的玻璃色譜芯片,并用于分離多環芳烴。這種溫度梯度芯片可在以4 ℃/s的溫度梯度升溫至200 ℃的梯度條件下工作。該課題組還利用玻璃材料優良的穩定性和機械強度,在同一套玻璃芯片的基礎上開發了芯片超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography, SFC)聯用雙光子激發(two-photon excitation, TPE)熒光光譜裝置。這一裝置可在20 s內完成色譜分離,且在20 mm/s的高流速下仍能得到高度對稱的色譜峰。

圖 1   芯片色譜基底材料

與硅和玻璃材料相比,聚合物基底材料具有更良好的加工性能,是目前微流控芯片領域最常用的芯片基底材料。基于聚合物材料,人們已發展了豐富的加工技術,如激光燒灼技術、軟光刻技術、噴射造型技術等。這些穩定且成熟的物理加工手段使得聚合物芯片具有較高的批次間重現性。然而,聚合物芯片在化學穩定性和機械強度方面,要普遍遜色于石英芯片和玻璃芯片。聚二甲基硅氧烷(PDMS)是目前應用最為廣泛的聚合物微流控芯片材料,PDMS具有優良的透光率和生物兼容性。同時,PDMS還極為柔軟(彈性模量約為500~4000 kPa),只需要施加一個大氣壓的壓力就可以引起PDMS一個維度上近10%的形變。這使得PDMS相比玻璃芯片可以更容易地實現芯片與其他設備的連接,甚至可以在PDMS芯片通道內直接加工泵閥結構。但PDMS的缺點亦十分明顯: PDMS材料在常用的色譜流動相溶劑中易發生溶脹;其較強的吸附性質和透氣性會導致較嚴重的色譜峰展寬;低彈性模量使得PDMS芯片無法承受高流體壓力,不適合高效液相色譜這類流體背壓較大的色譜方法。以上諸多問題使得PDMS材料在芯片色譜領域內的應用受到較大限制。但PDMS作為極易加工和批量生產的芯片材料,在微流控領域常作為原型設計使用。熱塑性材料(thermoplastics)的高分子鏈結構更加緊密,在加熱到玻璃化轉變溫度時熱塑性材料會由固態轉變為具有一定流動性的狀態,其冷卻后會固定形態的性質稱為熱塑性。熱塑性的芯片材料有:聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、環烯烴共聚物(copolymers of cycloolefin, COC)等。相比于以PDMS為代表的彈性體(elastomer),熱塑性材料具有更高的機械強度(如PMMA彈性模量可達3.2 GPa)、更強的抗溶劑腐蝕性能和更優良的可加工性。Wouters等開發了基于COC的高效液相色譜芯片系統(見圖1b),他們利用微銑削技術直接在COC基底上銑出芯片通道,通過溶劑-真空輔助鍵合技術封裝芯片,配合特別設計的芯片接口制成在38 MPa壓力下可長時間運行的COC液相色譜芯片,并利用這一系統完成了烷基苯酮的快速分離。還有一些特殊的芯片基底材料,如鈦、陶瓷、鉆石等,基于它們極高的機械強度、極強的耐腐蝕性能、極高的熱穩定性等原因,也被嘗試應用于芯片色譜基底材料。但由于它們較為苛刻的加工和制造條件,目前這幾類芯片基底材料還沒有被大規模的應用。

1.2 芯片色譜柱

最早投入使用的芯片色譜柱結構是開管柱(open-tube)。開管柱床的制備是在色譜柱通道內壁上修飾硅烷、凝膠、聚合物等作為固定相。開管柱因其中空的柱床結構而具有最小的分離阻抗,開管柱床可以相對容易地在芯片孔道內實現。但其中空的結構也導致開管柱的柱床比表面積低,相比低,色譜柱容量小。提高開管柱柱容量的關鍵是提高固定相層的比表面積。Collins等利用光引發聚合反應在毛細管上可控地生成聚合物開管柱床(見圖2a),所獲得柱床厚度的相對標準偏差在±0.8%,實現了高度可控的開管柱床制備。Yang等在制備柱床時,將聚合物前體與商品化的色譜填料顆粒混合注入刻蝕好的柱管,之后用紫外光引發聚合反應。生成的聚合物層將填料顆粒包裹并固定在管壁上形成柱床。這些工作在一定程度上改善了開管柱的上樣量,但仍無法從根本上解決開管柱的柱容量問題。

圖 2   芯片色譜柱床電子顯微鏡照片

填充柱床(packed bed)是將預先制備好的固定相填料顆粒通過流體帶動填裝進色譜柱管形成的色譜柱床。填充柱具有顯著優于開管柱的比表面積。由于柱管內充滿填料顆粒,填充柱流體背壓通常可以達到5~40 MPa。得益于色譜固定相技術數十年間的發展,填充柱擁有種類和功能都十分豐富的色譜固定相庫可供選擇。在微流控芯片上制備填充床需要解決兩個問題:(1)如何將填充顆粒固定在芯片孔道內;(2)如何提高填料裝填的重現性。固定填料顆粒常用的方法是在微流控芯片通道內構建柱塞(frit)結構。柱塞結構可以通過微加工手段制得,也可以利用原位聚合反應制備聚合物柱塞。Thurmann等利用激光輔助的光聚合手段在芯片通道中原位聚合生成一段約100 μm長的多孔聚合物整體柱塞。之后進行顆粒填料裝填形成色譜柱床,最后在柱床末端再聚合制備一段柱塞完成色譜柱床兩頭的固定。這種不到100 μm長的多孔聚合物整體柱塞能承受25 MPa的裝填壓力,可以很好地滿足芯片柱裝填和使用的承壓要求。Huft等利用PDMS的柔性,設計了一種多層PDMS多柱液相色譜芯片,并應用于免疫球蛋白基因逆轉錄PCR擴增產物的分離純化。這一芯片通過微閥擠壓芯片孔道形成局部錐形結構,利用基石效應(keystone effect)將色譜填料固定在柱管內。同時,他們還在芯片柱管壁上加工了大量微型旁路陣列,極大地減小了裝填時的阻力,可有效輔助填料在PDMS孔道內的裝填。旁路陣列在進行色譜分離時會通過微波照射封閉,不影響正常的色譜分離。本課題組的單顆粒柱塞技術也被運用到芯片填充柱的制備上。單顆粒柱塞是一種多孔的硅球顆粒,其顆粒尺寸略大于分離通道尺寸,此前常用于各類毛細管色譜柱的制備。使用時,只需將單顆粒直接塞入通道即可形成柱塞,使用方便可靠。Li等將多孔的單顆粒柱塞安裝進入芯片通道內用于固定填充柱床,制備好的芯片柱可在約34.4 MPa的高壓下工作。該芯片可在5 min內完成3種單胺類神經遞質的分離,理論塔板數達到100000塊/米。柱塞結構并非固定柱床的唯一方法,另一種方法是基于納米微球顆粒自組裝形成填充柱床。Shaabani等將甲基丙烯酸-2-羥基乙酯(HEMA)和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、光引發劑、致孔劑以及二氧化硅納米顆粒混合后注入PDMS芯片的通道。通過光引發使HEMA和EDMA聚合,聚合過程中二氧化硅納米顆粒發生自組裝相互交聯形成膠體自組裝(colloidal self-assemble, CSA)柱床(見圖2b)。該芯片在7天時間內進行28次蛋白質分離實驗,蛋白質的洗脫時間相對標準偏差小于0.83%,芯片分離能力穩定。同一蛋白質片段在不同芯片(3片芯片)間洗脫時間的相對標準偏差為4.3%,芯片間也有較好的重現性。納米填料顆粒自組裝形成的柱床具有較高的重現性,且對裝柱技術要求較低。但由于納米顆粒粒徑極小,導致柱背壓極大,因此除了電色譜方法外,其他液相色譜方法難以在納米顆粒自組裝柱床上使用。

整體柱床(monolithic bed)是一種通過聚合反應在色譜柱管內原位合成的固定相結構。相比于填充柱,整體柱的流阻較小,且不需要柱塞結構來固定柱床。相比于開管柱,整體柱具有更高的比表面積和柱容量。其原位聚合的模式也使整體柱在芯片色譜領域的應用備受關注。整體柱床主要的缺陷是: (1)聚合反應可控性較差,柱間重現性較難保證;(2)聚合反應的化學環境對芯片材料的選擇有限制;(3)在聚合反應前后,整體柱床的尺寸常發生一定“縮水”,容易導致柱床脫落。Kendall等開發了一種非原位的整體柱床制備方法。他們首先在一個芯片模具中制備整體柱床,之后拆開模具芯片并取出柱床。在對柱床做衍生化處理后,再將其放入一個通道尺寸縮小10%的芯片,最后封閉芯片完成制備。這種制備方式雖然失去了整體柱原位聚合的優點,但換來的是尺寸更加可控的整體柱床制備。在解決柱床收縮問題的同時,還可以實現不同功能化的柱床聯用,實現多維分離。除了常見的有機聚合物整體柱床,無機材料也被應用于芯片整體柱的制備:Zhai等開發了一種基于氧化石墨烯硅烷聚合物的分子印跡整體材料芯片色譜柱(見圖2c),并用于分離富集辣椒粉中的羅丹明B。他們將氧化石墨烯(GO)與3-氨丙基三乙氧基硅烷耦聯生成氧化石墨烯硅烷(GO/SiO2),之后通過交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)與GO/SiO2反應生成整體柱床。該芯片色譜柱對羅丹明B富集因子可達110,檢出限為0.40 ng/g。

柱陣列柱床(pillar array bed)是芯片色譜獨有的柱床結構。柱陣列柱床的原型是一種被稱為COMOSS(collocated monolithic support structure)的微流控芯片結構。這種結構由大量規則排列的微柱組成,通常是通過光刻結合深反應離子刻蝕(DRIE)技術加工制成。基于物理加工手段的制造方法使得柱陣列柱床具有極高的重現性,并且可以批量復制。單純的COMOSS結構比表面積較低,樣品載量低,作為色譜柱床使用需要對微柱陣列進行額外的修飾。Lincoln等研究了在柱陣列表面修飾多孔層的厚度對柱效以及保留時間的影響。多孔層厚度的增加對理論塔板數的提升較小,但保留性能會有明顯的增加。同時,極大提高的比表面積也對柱陣列柱床的載樣能力有顯著提升。Desmet課題組對柱陣列色譜(pillar array chromatography, PAC)技術的成熟完善以及應用做了較為系統的工作(見圖2d),包括:柱陣列色譜柱的制備、流體動力學模型、柱陣列多孔層研究、柱陣列長柱制備等方面。尤其在柱陣列芯片色譜長柱制備上,Desmet課題組做出了系統性的工作。Baca等利用串聯4張柱長為2 m的柱陣列色譜芯片得到的8 m長的柱陣列色譜柱分離小分子混合物,在2050 min的梯度時間內得到了1815的峰容量。由于柱陣列的結構特點,相比于8 m的柱長,該串聯芯片組可以在較低的流體壓力(25 MPa)下以0.60 mm/s的線速度完成分離。

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