癌癥的精準診療是提高癌癥患者生存率和生存質量的重要手段。液體活檢通過采用非侵入采樣方式, 獲取腫瘤病人全面、準確、實時的基因組、轉錄組及蛋白組等生物學信息, 是一種新興的癌癥診斷技術, 對癌癥精確診斷、個體化治療、預后評估等方面具有重要意義。循環腫瘤細胞(CTC)是一種從實體瘤組織脫落進入外周血的腫瘤細胞, 因能提供完整的細胞生物學信息, 是最具應用前景的液體活檢靶標。然而, CTC的數量極其稀少、異質性強、所處外周血環境復雜等特點, 給CTC的富集和分析帶來了巨大的技術挑戰。

上海交通大學楊朝勇教授總結其課題組近年來發展的基于CTC液體活檢策略, 著重討論在CTC識別、富集與單細胞分析等方面的研究進展。相關專題論述在線發表于《中國科學：化學》中文刊。

癌癥嚴重威脅人類的生存健康, 是導致人類死亡的第二大病因。據統計, 2015年全球約有1750萬新發的癌癥患者, 870萬例死亡與癌癥相關。癌癥的早期篩查、精確診斷和預后監測是提高癌癥患者生活質量及生存率的重要手段。作為腫瘤診斷的金標準, 組織活檢存在取樣難、侵入性大、代表性不全、并發癥風險高等不足。

近年來, 針對體液(血液、尿液、胸腔積液等)中的生物標志物包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)、循環腫瘤DNA (ctDNA)、外泌體(exosome)等的檢測技術, 即液體活檢, 被認為是癌癥體外檢測的重要發展方向。

與經典組織活檢相比, 液體活檢技術具有取樣方便、侵入性小、信息全面、無放射性污染、成本低等優勢, 是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段之一, 已成為當前癌癥診斷領域的前沿熱點。CTC是從實體瘤組織脫落進入外周血的、完整的腫瘤細胞, 與腫瘤轉移密切相關; ctDNA是由腫瘤細胞凋亡釋放在外周血中的游離DNA片段, 并攜帶腫瘤相關的遺傳學突變, 能夠反應腫瘤組織的突變圖譜, 是早期篩查、預后評估的重要監測指標; 外泌體是存在于體內的細胞外囊泡, 包含有腫瘤細胞相關的核酸、蛋白質等, 實現細胞間的信息遞送, 近年來被發現外泌體是腫瘤檢測的重要靶標之一。

相比于碎片化的ctDNA片段和納米尺度的外泌體, CTC由于其完整的細胞性質, 不僅能夠提供腫瘤病灶的基因組變異、mRNA表達異常、蛋白質組變化等物質信息改變, 還能從細胞形態、遷徙能力、藥物刺激響應研究等方面對腫瘤的轉移、耐藥機制進行研究, 能全面、系統地反映腫瘤病灶的分子病理分型, 因此尤為受到關注。大量研究證明, CTC的檢測分析在腫瘤診斷、病程監測、療效評估、藥物開發、個體化治療等方面具有重大意義。

CTC早在1869年就被Ashworth等發現報道, 但直到20世紀90年代中期, CTC相關研究報道才逐漸增多, 主要原因在于CTC的檢測分析存在較多技術挑戰。首先, CTC數量極少, 通常1mL外周血中僅含有1~100個CTC, 而血細胞的數量數以億計。在如此龐大復雜的背景細胞下, 很難實現CTC的高靈敏檢測。因此, 發展高效的富集方法是CTC檢測分析的關鍵步驟和重要前提。

目前主要有兩類富集方法, 第一類是基于CTC和血細胞尺寸、密度、介電性等物理特性差異, 通過微過濾、離心、介電泳等方法實現CTC的富集。但這類方法存在特異性差、純度低等不足。另一類是基于CTC和血細胞表面標志物差異, 利用識別分子修飾的磁珠或微納芯片親和富集CTC。這類方法具有特異性強、純度高等優點, 是目前最常用的CTC富集策略。但CTC存在不同的亞群, 無通用標志物; 且有些CTC會發生上皮-間質轉化(EMT), 其標志物表達水平處于動態變化中。目前通常采用的上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗體親和富集CTC的方法, 會“漏檢”EpCAM低/不表達的CTC, 也難以實現CTC的分型捕獲。因此, 發展高效、特異的新型識別分子, 實現CTC富集和分型分析具有重要的意義。

腫瘤組織內和腫瘤組織間都存在異質性的腫瘤細胞, 來源于實體瘤CTC同樣存在較強的異質性。研究表明, 只有少數CTC具有轉移能力及腫瘤耐藥性突變等。傳統以細胞群體為對象的分析方法, 容易掩蓋細胞-細胞之間微小的差異, 難以實現CTC腫瘤異質性的研究。因此, 單細胞水平的CTC組學研究具有重要的意義。為實現CTC的單細胞分析, 需要解決兩個技術難題: (1) 對富集捕獲的CTC實現無損釋放, 方便下游培養及表征分析, 獲得CTC的真實生物學信息; (2) 建立高通量單細胞分析平臺, 精準地挖掘CTC與正常細胞、CTC之間的異質性, 檢測CTC的組學變化, 進而推動腫瘤轉移機制研究及個體化治療的發展。

微流控技術是在微米級通道內進行流體控制以實現微量的生物、化學相關實驗過程的新興技術。基于微型化、自動化、集成度高、分析速度快等優點, 微流控技術在CTC分離富集和單細胞分析中具有顯著的優勢。通過對微通道、腔體的結構設計, 能夠針對CTC的物理、生化性質實現特異性分離與富集。另一方面, 通過微孔、卡槽、微液滴等單細胞分散手段的組合, 實現對捕獲的CTC進行高通量分散操控, 并提供納升到皮升的反應空間, 達到對CTC的高效精準單細胞分析, 是極具前景的分離分析技術。

針對基于CTC液體活檢的發展和臨床應用需求, 上海交通大學楊朝勇課題組從發展新型高親和力的識別分子、建立高效富集CTC的微流控平臺、構筑高通量的單細胞分析方法三個層面解決目前CTC測不準、數不全的難題和單細胞檢測分析的需求。近期發表于《中國科學：化學》的文章總結了在核酸適體篩選新策略、CTC高效富集方法及高通量單細胞分析方法的研究進展。

循環腫瘤細胞分析過程示意圖

CTC作為液體活檢技術中的重要靶標, 已被美國臨床腫瘤學會推薦為腫瘤標志物, 可作為腫瘤TNM分期的重要補充。外周血中CTC的個數和生物學信息與實體瘤組織存在一定的量效關系, 因此, CTC個數檢測及組學信息分析對腫瘤診斷、療效監測、預后評估、個體化治療的臨床應用及腫瘤轉移及抗藥性等機制的研究具有重大意義。然而, 由于其個數少、異質性強, CTC檢測分析仍存在巨大的挑戰。首先需要選擇高通量、高效率的CTC分離富集方法。以免疫識別為核心的富集手段, 雖能實現高效、高純度的CTC富集, 但是依賴標志物表達的分離方法容易漏掉低表達/不表達的CTC, 而這些CTC往往是侵襲能力的亞群。此外, 免疫識別過程需要考慮到識別分子與細胞之間的作用力, 限制了微通道中的流體速度進而限制了芯片的通量, 另外, 以細胞物理性質差異實現CTC富集的物理分離方法, 雖可以規避免疫識別過程, 提高通量。然而物理分離方法, 一般純度較低、丟失率較高, 容易漏掉與血細胞有尺寸重疊的CTC亞群, 限制了其臨床應用。因此, 結合多種原理, 實現CTC分離富集, 將會是未來CTC分離技術發展的核心思路。

核酸適體作為高特異、高親合力的識別分子, 雖可通過體外篩選技術獲得任何腫瘤細胞靶標的識別分子, 但大量研究表明, 核酸適體在外周血環境中, 容易受到核酸酶、緩沖環境等干擾, 使其穩定性和結合力受到影響。因此, 以外周血等復雜基質為篩選條件的核酸適體篩選方法的開發, 將會大大擴展核酸適體分子在CTC識別富集中的應用。此外, 利用納米材料、聚合物等提高核酸適體的穩定性, 構建核酸適體多價效應等方式, 也將大大提高現有核酸適體的使用范圍。

CTC的數目雖能做為腫瘤分期的補充, 但是CTC本身攜帶的組學信息更具有研究意義。要實現CTC的下游分析, 首先需要實現CTC的無損釋放。已經有不少課題組開發了CTC的釋放方法, 如溫度響應、核酸酶水解、光切割。這些方法雖在細胞系實驗中展示了>95%的釋放效率, 但是在臨床樣本體系, 仍存在釋放效率低、損失率高等問題。因此, 亟需發展適用于臨床應用的CTC釋放方法。

CTC單細胞分析技術是CTC研究的重點方向。CTC單細胞測序方法可以比較CTC與原發灶、轉移灶以及轉移淋巴結中基因組、轉錄組及表觀遺傳組的差異, 為認識腫瘤發生、發展及轉移的生物學機制提供全新的視角。例如, 2017年, Gao等對一位結腸癌患者的CTC、原發灶腫瘤細胞、轉移淋巴結細胞進行了全基因組測序分析, 發現CTC拷貝數變異(CNV)存在較大的異質性, 揭示了可能只有部分腫瘤細胞可能形成轉移灶。因此, 單細胞全基因組測序提供了從根源上分析原發灶、CTC、轉移灶的遺傳變異的手段, 揭示腫瘤轉移機制的可能性。

其次, 單細胞轉錄組測序和表觀遺傳學分析技術也處于蓬勃發展的狀態。單細胞轉錄組擴增技術的發展解決了單細胞轉錄組樣品量少而難以檢測的問題, 實現了對單細胞全轉錄組的測序。特別是以液滴微流控技術和編碼技術為基礎的Drop-seq和inDrop技術發展, 使得快速、便宜、高通量的單細胞RNA測序成為了可能。基于液滴微流控的商用高通量單細胞轉錄組平臺已經廣泛應用于細胞分型、干細胞增殖與分化、腫瘤異質性研究、腦/神經系統發育、免疫異常研究等領域。隨著CTC富集技術的發展, 高通量單細胞轉錄組測序技術必將在CTC領域發揮不可替代的作用。

張惠敏, 吳玲玲, 林冰倩, 王奕迪, 畢云鵬, 王煒, 宋彥齡, 楊朝勇. 基于微流控技術的循環腫瘤細胞分析研究進展. 中國科學：化學, 2019

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