4.基于質譜的全球單細胞蛋白質組學分析技術

已經投入了大量努力來提高非靶向蛋白質組學工作流程的靈敏度，以達到具有良好覆蓋率、魯棒性和可靠性的單細胞分辨率。與基于親和力的方法相比，非靶向蛋白質組學分析允許對細胞蛋白質組進行全局映射，因此是面向發現的基礎研究和臨床研究的理想選擇。各種樣品制備方法、自動化儀器和LC-MS開發的最新進展使我們能夠使用無標記方法對單個細胞中的1000多種蛋白質進行定量。在下文中，我們將討論這些令人興奮的發展，其中包括簡要討論用于單細胞分析的LC-MS系統的演變、微流體支持的上游樣品處理以及隨后的數據采集和分析工作流程（圖4）。

4.1微組學和單細胞蛋白質組學的MS進化

基于MS的蛋白質組學無疑是大規模分析蛋白質組的組成、結構和動態變化的最全面的方法，它可以提供蛋白質與生物學或疾病的功能聯系和分子機制。它已被廣泛應用于各種樣品（如細胞系、動物模型和人類臨床標本）的蛋白質表征、翻譯后修飾和蛋白質動力學。它在蛋白質生物標志物發現方面的實施激發了提高蛋白質組學分析靈敏度的巨大進步，以克服臨床標本的分析挑戰，這些標本通常以微量存在，如初級免疫細胞和稀有細胞的子集。雖然基于MS的蛋白質組學已經鑒定出從微尺度（微克，>1000個細胞）到大樣本的>103-104種蛋白質，但以MS為中心的SCP主要受到缺乏小型化樣品處理方法、高效分離策略和靈敏的MS儀器的阻礙。隨著小型化樣品制備的最新進展以及LC分離和MS儀器的改進，對單個細胞的靈敏測量的追求一直在迅速擴大。以下部分將討論這些進展，并詳細介紹基于微流體的SCP分析。

小型化樣品制備在傳統的蛋白質組學工作流程中，通常需要大量的樣品（>105個細胞；20μg至1 mg蛋白質），到小規模的微基因組學（<1000個細胞；<1μg蛋白質），大部分努力都集中在改進微管和定制尖端的樣品預處理上，以提高分析靈敏度。例如，Kulak等人報道了in-StageTip（iST）方法，其中樣品操作是在含有由反相珠制成的非常小的圓盤的尖端中進行的。Manza等人介紹了過濾輔助樣品制備（FASP），其中十二烷基硫酸鈉（SDS）和其他干擾LC-MS/MS分析的污染物通過分子量截止過濾裝置去除。同樣，Hughes等人開發了使用表面官能化順磁珠進行肽脫鹽的一鍋固相增強樣品制備方法（SP3）。這些技術最大限度地減少了樣品轉移過程，使增強分析能夠減少到幾百個細胞，蛋白質組學覆蓋范圍在3500-4500之間。與此同時，Chen等人報道了用于探測100個細胞的集成蛋白質組分析裝置（iPAD）（iPAD-100），由此將活細胞注射到裝置中以進行后續的蛋白質組學處理和分析。該裝置由浸入細胞懸浮液的入口針、控制樣品處理過程的10端口閥、用于輸送樣品的微型注射器、用于蛋白質消化的毛細管回路（長40cm，內徑100μm（i.d.））和用于脫鹽的C8柱組成。iPAD-100從100個細胞中鑒定出635種蛋白質。后來，該設備升級為SCP分析的集成系統（iPAD-1）。使用4.5倍小的毛細管（內徑22μm）作為單細胞輸入的關鍵部件，細胞裂解和蛋白質消化在2nL內完成，結果顯示樣品損失顯著減少。總體而言，iPAD-1從單個HeLa細胞中平均鑒定出180種蛋白質。

LC儀器的進步增強色譜分離和分辨率的顯著進步極大地促進了超靈敏蛋白質組分析。已知LC內徑的小型化和較低的流速也可以增強分離，從而大大增加向質譜儀的離子輸送，并提高檢測靈敏度。已經報道了各種窄孔柱，包括在50 nL min?1的流速下內徑從75μm減小到30μm，將信號強度提高3倍，超窄孔填充柱在20 nL min-1的流量下內徑為20μm，實現單細胞約800個蛋白質的覆蓋率，與30 nLC系統相比，使用picoLC系統（2μm內徑和800 pl min?2）的靈敏度提高了163倍和10至100倍。μm-i.d.柱。174幾個小組報告了用于低輸入蛋白質組學的微流控柱陣列柱（μPAC），其由柱間距為2.5μm的較窄柱組成，柱間填充有高度有序的固定C18珠，以250 nL min?1的流速運行，證明了對單個細胞中>1000種蛋白質的一致定量。

5.SCP在生物學和臨床研究中的應用

5.1靶向單細胞蛋白測定的應用

我們介紹了各種基于微流體的靶向SCP檢測的生物學和臨床應用（圖5）。由于微流體的獨特能力，它們對靶向SCP的實施促進了各種細胞生物學研究和臨床研究。例如，CyTOF是靶向SCP分析最廣泛使用的方法之一，200提供了探索不同腦細胞中細胞表型的應用（基于信號標記物和細胞因子），免疫細胞分化，基于表面標記物的細胞異質性，和癌癥相關信號。 CyTOF與細胞成像相結合，也被應用于探索組織內或細胞過程中單個細胞中蛋白質的亞細胞分布，促進了我們對免疫細胞功能的理解，以用于免疫治療應用。最近，Neuperger及其同事使用單細胞CyTOF進行了研究。基于13種蛋白質的表達模式的非小細胞肺癌細胞（NSCLC）系中的異質性和肺腺癌中的瘤內異質性。同樣，SCBC方法用于測量各種分泌、細胞質或膜蛋白的多重蛋白質豐度（由細胞產生的拷貝數決定）。通過仔細選擇和監測特定蛋白質標記的表達，SCBCs可以成為研究多種生物系統的工具。例如，異質性（細胞-細胞變異）可以通過監測參與不同信號通路的關鍵表型標記、轉錄因子和信號效應器的差異表達來解決。SCBC方法也被用于通過測量在近距離孵育的細胞釋放的分泌蛋白來探索細胞相互作用和通信。這種方法用于了解細胞在不同分離條件下如何相互作用，以及信號蛋白如何影響相鄰細胞。選擇性蛋白質標記的SCBC分析確實已成為研究功能異質性、117條信號通路、208條細胞間相互作用、207個細胞通訊、119個免疫細胞反應、和CTC分析的有前景的工具。Su等人應用SCBC芯片監測了18種蛋白質，包括表型標記、轉錄因子、單個黑色素瘤細胞中的信號效應器，以探索藥物誘導的信號動力學。這項研究揭示了黑色素瘤在BRAF抑制劑治療下的表型轉變，BRAF抑制劑激活了包括MEK/ERK和NF-κB在內的替代通路，進一步加速了腫瘤進展和耐藥性。表型。此外，Ullal及其同事使用SCBC探索了肺腺癌患者的腫瘤間和腫瘤內異質性，并仔細選擇了90個靶標志物來覆蓋臨床中使用的標志性途徑（如DNA損傷、細胞死亡）和診斷標志物。

SCP研究正以前所未有的速度蓬勃發展，對超靈敏分析的持續努力受益于多種因素，例如迄今為止討論的令人興奮的技術和分析發展。從用戶的角度來看，選擇最合適的SCP方法可能是針對特定主題的；不太可能有一種適用于所有目的的單一SCP策略。基于親和力的SCP方法非常適合探測一組特定的蛋白質，這些蛋白質的功能是已知生物現象或驅動疾病進展的關鍵決定因素。與此同時，基于MS的工作流程提供了無與倫比的功能，允許以發現為導向的研究來研究與關鍵生物過程相關的蛋白質的組成、豐度和功能狀態，并將成為全球蛋白質組分析的有利選擇。

到目前為止，靶向SCP方法已經報道了使用CycMIST方法檢測同一批單細胞中多達182種蛋白質的分析。毫無疑問，對于基于親和力的SCP，一個主要的瓶頸是可靠抗體的可用性和特異性，以及相應熒光探針和檢測通道的容量和兼容性。為了向前發展，開發更多的正交親和探針，允許靈活標記和多重化學功能化，將能夠以更高的通量研究靶向SCP。靶向SCP的另一種策略是用適配體代替抗體，適配體產生更高的多重性（>1300個蛋白質），而其他指標（如動態范圍和特異性）也會受到影響。

考慮到LCN蛋白通常在MS衍生的測量中被掩蓋，靶向SCP與新型傳感器相結合可能會提供超敏感性的利基。與基于微流體的儀器集成的激光誘導熒光（LIF）和SERS在檢測LCN蛋白方面處于領先地位。為了提高多路復用性和吞吐量，其他傳感方式也值得考慮。例如，磁阻生物傳感是一個很強的候選者，因為它的超靈敏度來自大多數生物樣品表現出可忽略的磁背景。這種基質不敏感性大大降低了樣品預處理的復雜性。此外，對磁彈性測定法的研究表明，時間特征可以通過改變磁性納米顆粒的材料和尺寸來增加多路復用性。因此，微流體與磁阻納米傳感器的集成有望有利于LCN方案的目標SCP分析。

MS是全球蛋白質組學分析的核心工具。然而，全球SCP面臨著與肽離子向質譜儀的低效輸送以及單次運行中分析更多單細胞的有限通量相關的挑戰。為了促進使用MS的全球SCP，已經進行了實驗和計算工作，以提高分析吞吐量和靈敏度。如本綜述所示，SCP技術的最新實驗改進一直強調通過最小化樣品體積和縮放多個樣品的分析來減少樣品損失。雖然這些方法提供了整體工作流程的小型化，但它們目前缺乏處理數百個單細胞的吞吐量。為了提高吞吐量，通過TMT標記進行多路復用需要額外的樣品處理步驟，以顯著提高MS吞吐量。迫切需要一個微流體平臺，用于無縫集成小型化單細胞樣品制備和標記，以實現更高通量的SCP分析。提高靈敏度的另一個方面是（1）將肽樣品轉移到LC和（2）單細胞水平樣品的色譜分離的改進，這進一步實現了向MS儀器的有效離子輸送。在這個利基市場中，微流體裝置可以直接與LC-MS/MS結合，以進一步增強單細胞鑒定深度。從長遠來看，基于微流體的分離、分餾和電離與質譜的直接耦合可以進一步避免耗時的LC分離的需要。另一方面，微流體裝置可以功能化或填充適當的富集珠/材料，以從低樣本量（甚至單細胞）中富集翻譯后修飾的蛋白質（如磷酸化或糖基化的蛋白質），或純化（通過分選和分離）稀有細胞，如CTC，用于后續的SCP分析，以鑒定新的藥物靶點和生物標志物。此外，自動柱組成（C18顆粒或μPAC）、柱長、梯度時間、流速和其他與LC正交的方法是高靈敏度“無損”SCP需要考慮的關鍵領域。結合上述能力，指定的數據采集策略和適當的數據分析管道（如樣本大小的庫）前瞻性地最大限度地提高了大規模臨床SCP的蛋白質組學深度、再現性、靈敏度和吞吐量。

除了基于微流體的工作流程的改進外，分析下游SCP數據的標準化計算管道也很有趣。目前的光譜數據處理方法表現出有限的識別率、相對耗時的庫構建和吞吐量，這影響了從SCP數據中提取生物關鍵信息。為此，基于深度學習的模型可以與計算管道一起使用，以提高識別能力，并生成預測庫，以盡可能少的資源補充實驗庫。

在目前的蛋白質組學深度，SCP技術已經在單細胞分辨率上展示了幾種應用。這些應用已經從細胞系擴展到單個細胞水平的空間分辨腫瘤組織。這些研究大多集中在樣品制備的改進或數據采集策略的優化上，最新技術使每個細胞能夠鑒定1000-1500種蛋白質。為了應對微基因組學，最近，plexDIA將非等壓質量標簽與DIA相結合，分析納克級樣品，從而提高吞吐量，并以98%的數據完整性量化每個細胞約1000種蛋白質。展望未來，SCP MS有望實現測量數千多種蛋白質和量化單個細胞中功能相關蛋白質的目標，這將進一步促進SCP在更廣泛的生物系統中的應用，并指導醫學的未來。這一進展反過來將加速診斷疾病和探索癌癥治療藥物靶點的臨床檢測的發展。最近的SCP發展也有可能改變發育生物學。隨著從典型哺乳動物細胞中鑒定出1000多種蛋白質，基于微流體的方法有望從卵母細胞或早期胚胎等大型細胞中檢測出數千種蛋白質。通過上述改進，SCP將為干細胞分化、早期胚胎發育和器官發育提供有價值的見解。

隨著微流體細胞檢測技術的進步，單細胞的微操作驗證了核酸和蛋白質的可控取樣，為動態細胞生物學的研究鋪平了道路，其中細胞間通訊、微環境調節和時空細胞動力學被揭示。由于僅依賴單體信息有限地回答和連接了基因型和表型之間潛在的生物不確定性；CITE-seq和nanoSPLITS 等幾項工作將蛋白質組學工作流程與成熟的單細胞RNA測序技術相結合，實現了雙模分析。最近，各種微流體平臺（無論是液滴還是微孔）已經提出了多模態分析，由此產生的大數據框架需要在生物信息學上實施深度學習，這在計算上推動了多組學時代的到來。展望未來，預計多層微流體可以設計為容納多個功能模塊，用于進行多組學或動態細胞生物學實驗。

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