通過基于液滴的分析評(píng)估的抗真菌功效結(jié)果的驗(yàn)證

通過比較基于液滴的分析以及WA和96孔板測(cè)定評(píng)估的kunshi抗真菌潛力的結(jié)果，驗(yàn)證了平臺(tái)抗真菌評(píng)估的效率。使用WA測(cè)定法的抑制百分比最低。在所有測(cè)試濃度下，孵育 4 小時(shí)后，通過 96 孔板和液滴測(cè)定評(píng)估的抑制百分比彼此更接近于 WA（表 2）評(píng)估的百分比。在4小時(shí)和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，使用液滴測(cè)定法計(jì)算的抑制百分比介于WA和96孔板測(cè)定獲得的值之間，所有藥物濃度≤0.5μgμL-1，而在濃度≥2μgμL-1時(shí)，液滴測(cè)定中記錄了最高的抑制。在不使用抗真菌劑的情況下，在所有三種測(cè)定（水瓊脂，96孔板和液滴測(cè)定）中真菌孢子的活力為100%。

在本研究中，我們成功開發(fā)了一種基于液滴的微流控平臺(tái)，用于對(duì)植物病原真菌鏈格孢的單個(gè)包封孢子進(jìn)行抗真菌分析。這項(xiàng)工作依賴于植物病理學(xué)和殺菌劑分析方法領(lǐng)域的一系列關(guān)鍵新進(jìn)展，例如：（1）開發(fā)了一種用于單孢子封裝的片上方法，（2）演示了一種基于生物相容性液滴的測(cè)定，使用互花米孢作為絲狀真菌的模型系統(tǒng)，在液滴中存活長達(dá)24小時(shí)， （3）使用基于微流體液滴的系統(tǒng)進(jìn)行抗真菌分析的能力。基于微流控的殺菌劑分析平臺(tái)可進(jìn)行可重復(fù)的抗真菌分析。以前，已經(jīng)專門進(jìn)行了研究以執(zhí)行基于液滴的操作，例如細(xì)胞封裝，液滴混合，片上孵育，液滴合并和液滴分選。然而，這些液滴操作中的每一個(gè)都被證明是單獨(dú)的模塊，尚未組裝到集成的抗真菌分析測(cè)定中。在這里，通過結(jié)合片上孢子活力和液滴中的抗真菌分析測(cè)定，我們能夠開發(fā)一個(gè)基于液滴的平臺(tái)，用于對(duì)植物病原絲狀真菌 A. alternata 進(jìn)行殺菌劑分析。

為了驗(yàn)證抗真菌分析平臺(tái)，使用 WA 和 96 孔板測(cè)定進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于所有3種測(cè)定，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量互花米草孢子萌發(fā)的抑制百分比，即孵育4小時(shí)和24小時(shí)后，以檢查昆氏抗真菌功效的持久性。在所有測(cè)試濃度下，通過液滴測(cè)定評(píng)估的抑制百分比更接近 96 孔板和 WA 測(cè)定（表 2）。Pearson相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果（表3）。皮爾遜相關(guān)系數(shù)衡量兩個(gè)連續(xù)變量之間的統(tǒng)計(jì)關(guān)系或關(guān)聯(lián)。它被稱為測(cè)量感興趣變量之間關(guān)聯(lián)的最佳方法，因?yàn)樗趨f(xié)方差方法。分析表明，在孵育4小時(shí)時(shí)，96孔板測(cè)定和液滴測(cè)定之間存在高度相關(guān)性（表3）。微量滴定和微滴測(cè)定之間的這種高度相關(guān)性可以解釋為PDB飽和的環(huán)境，類似于水和營養(yǎng)物質(zhì)的可用性，與傳統(tǒng)的96孔板高度相似。相關(guān)性分析表明，在平臺(tái)上獲得的結(jié)果與在WA和96孔板24 h獲得的結(jié)果沒有顯著差異（P < 0.05）。因此，該平臺(tái)可用作進(jìn)行抗真菌分析的工具，其結(jié)果將與傳統(tǒng)的 96 孔板和 WA 檢測(cè)獲得的結(jié)果相當(dāng)。在孵育4小時(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)的液滴測(cè)定與WA之間的相關(guān)性較低，這可以通過以下事實(shí)來解釋：WA技術(shù)依賴于測(cè)試化合物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，因此與稀釋方法相比，培養(yǎng)基中的濃度不均勻。液滴測(cè)定和 96 孔板和 WA 測(cè)定之間抑制百分比的總體差異是由于 WA 和 96 孔板方法對(duì)孢子的批量分析，這是基于液滴的平臺(tái)通過直接可視化微流控芯片中封裝的孢子來解決的問題。此外，微流控芯片具有存儲(chǔ)位置，可以不受分析時(shí)間的影響來觀察相同的孢子，與96孔板和WA檢測(cè)相比具有優(yōu)勢(shì)。該資產(chǎn)是基于 droplet 的平臺(tái)的主要功能之一。最后，在3種不同的孢子萌發(fā)試驗(yàn)中，計(jì)算了半最大有效濃度（EC50）的孢子抑制作用。通過液滴和 96 孔板測(cè)定評(píng)估的范圍為 0.125 至 0.25 μg μL?1，而通過 WA 測(cè)定評(píng)估的 EC50 范圍為 0.25 至 0.5 μg μL?1，表明這些化合物表現(xiàn)出劑量依賴性抗真菌活性。

已經(jīng)有相對(duì)較少的已發(fā)表報(bào)告比較了確定對(duì)植物病原體的抗真菌功效的方法。據(jù)我們所知，殺菌劑評(píng)估測(cè)定方法尚未取得重大進(jìn)展。在對(duì)涉及孢子萌發(fā)的技術(shù)的觀察中，Gottlieb45發(fā)現(xiàn)接種的有毒物質(zhì)瓊脂法和試管稀釋法同樣敏感。這些結(jié)果與目前的結(jié)果一致，其中所有三種測(cè)定法測(cè)量的抑制百分比彼此接近，并且彼此密切相關(guān)，表明基于液滴的分析可以產(chǎn)生同樣靈敏的結(jié)果。在另一項(xiàng)研究中，通過兩種方法測(cè)試了月桂油、肉桂葉油、丁香油、檸檬草油、芥末油、橙油、鼠尾草油、百里香油和兩種迷迭香油：（1） 補(bǔ)充有 100 和 250 μL L-1 精油的黑麥面包和 （2） 暴露于空氣中 136 和 272 μL L-1 揮發(fā)油的真黑麥面包。結(jié)果表明，精油的抗真菌效果取決于施用方法。使用不同方法的研究進(jìn)行比較是困難的，并且強(qiáng)調(diào)了在測(cè)試活動(dòng)時(shí)需要統(tǒng)一和可靠的程序。

基于液滴的新型分析平臺(tái)的結(jié)合有助于定制和優(yōu)化現(xiàn)有體外模型中目前缺少的抗真菌評(píng)估技術(shù)，為研究真菌孢子的生物學(xué)和生理學(xué)提供了一個(gè)平臺(tái)。液滴（直徑100μm）以每小時(shí)5.4×103個(gè)液滴的通量生產(chǎn)，油壓= 210 mb，孢子懸浮壓力= 200，殺菌劑壓力= 200。通過增加并行通道、多個(gè)微流控芯片和增加整體壓力，可以提高平臺(tái)的總吞吐量。HT分析可以通過將平臺(tái)與芯片和陷阱的自動(dòng)圖像分析相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)（例如使用自動(dòng)顯微鏡和圖像分析或高內(nèi)涵篩選顯微鏡方法）。開發(fā)的平臺(tái)可以通過優(yōu)化條件，根據(jù)所使用的絲狀真菌，在液滴大小、孵育條件（溫度、光周期、培養(yǎng)基等）方面擴(kuò)展到其他絲狀真菌。基于液滴的抗真菌分析可以使用標(biāo)準(zhǔn)化方法，因?yàn)椋╝）它主要使用已經(jīng)達(dá)到工業(yè)質(zhì)量水平和生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的市售儀器，即光學(xué)顯微鏡，流量控制儀器，熱塑性芯片，（b）一些關(guān)鍵步驟可以半自動(dòng)或完全自動(dòng)化和精細(xì)控制，例如流速或體積控制。微流控控制器帶來的自動(dòng)化有助于確保每個(gè)液滴的高重現(xiàn)性（相當(dāng)于板孔），并減少人為錯(cuò)誤的影響，（c）它依賴于單個(gè)孢子分析而不是批量分析。微流控芯片中單個(gè)封裝孢子的直接可視化確保了結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，從而最大限度地減少了偏倚的結(jié)論。這也為驗(yàn)證對(duì)給定殺菌劑的反應(yīng)的潛在異質(zhì)性提供了可能性。微流控芯片中的特定存儲(chǔ)位置使得觀察相同的孢子與分析時(shí)間無關(guān)，與96孔板和WA測(cè)定相比具有優(yōu)勢(shì)，（d）結(jié)果重復(fù)了使用兩種常規(guī)方法進(jìn)行的觀察結(jié)果，從而驗(yàn)證了本系統(tǒng)，并與此類傳統(tǒng)方法相比具有互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)， （e） 它包括明場(chǎng)顯微鏡分析，這是所有光學(xué)顯微鏡照明技術(shù)中最簡單的。平臺(tái)的簡單性及其與基本設(shè)備（光學(xué)復(fù)合顯微鏡）的集成有助于將該平臺(tái)作為標(biāo)準(zhǔn)分析工具，因此很容易被許多研究人員復(fù)制，（f）該系統(tǒng)包括一個(gè)市售的微流控芯片，該芯片已經(jīng)滿足大規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)，可以用作現(xiàn)成的消耗品。與使用自制芯片（例如PDMS芯片、微銑削等）的其他微流控方法相反，這些方法在制造過程中可能會(huì)產(chǎn)生一些變化，而使用通常通過模具注射制造的眾所周知的熱塑性塑料（例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等）的大規(guī)模芯片生產(chǎn)通常具有顯著較小的單元和批次之間的差異性， （g） 系統(tǒng)能夠在較低的基礎(chǔ)設(shè)施下進(jìn)行抗真菌分析， 人工和消耗品。單個(gè)孢子的封閉允許在液滴內(nèi)快速跟蹤和觀察，從而減少總體評(píng)估時(shí)間。該技術(shù)可以快速分析抗真菌活性，并可集成到工業(yè)殺菌劑篩選過程中，以加快發(fā)現(xiàn)新的抗真菌劑。這一優(yōu)勢(shì)將增加采用該技術(shù)及其向標(biāo)準(zhǔn)化模型發(fā)展的興趣。該技術(shù)可用于封裝具有不同孢子大小的不同類型的真菌，甚至是真核或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。精確的孢子封裝、HT 液滴的產(chǎn)生和操作以及組合篩選的可能性表明，液滴技術(shù)可以用作一系列篩選方法的理想平臺(tái)。我們開發(fā)了一種液滴技術(shù)，該技術(shù)不僅可用于任何大規(guī)模的抗真菌分析研究，而且還非常適合分析抗真菌劑的作用方式和真菌的耐藥性發(fā)展。雖然我們只提供了獲得的鏈格孢菌萌發(fā)抑制數(shù)據(jù)，但該平臺(tái)可以進(jìn)一步擴(kuò)展，用于分析在細(xì)胞機(jī)制中起關(guān)鍵作用的抗真菌劑的分子機(jī)制。更深入地了解抗真菌劑的作用方式將有助于優(yōu)化其應(yīng)用，從而有助于它們?cè)谑称泛惋暳仙a(chǎn)中的成功使用。通過在液滴產(chǎn)生后立即向芯片填充油，可以最大限度地減少液滴的蒸發(fā)和泄漏。使用了表面活性劑（1%），該表面活性劑在限制泄漏方面非常有效，并且可以有效地將親水性和疏水性分子包含在液滴中。t = 0 h （100 μm），t = 4 h （99.97 μm） 和 t = 24 h （99.47 μm） 處的液滴大小。在不同時(shí)間點(diǎn)（t = 0，t = 4 h和t = 24 h）計(jì)算的液滴大小差異可以忽略不計(jì)，這進(jìn)一步證實(shí)了液滴中抗真菌劑的泄漏是微不足道的。然而，根據(jù)所使用的生物活性分子（疏水性/親水性），不同的方法可能需要額外的控制來優(yōu)化液滴的泄漏。總之，我們成功開發(fā)了一種多功能且高效的微流控系統(tǒng)，用于封裝真菌的單個(gè)孢子，然后對(duì)液滴進(jìn)行抗真菌分析。

微流控PDMS芯片制造和單孢子封裝

通過軟光刻技術(shù)創(chuàng)建了微流控芯片。該芯片在AutoCAD 2018軟件下設(shè)計(jì)（圖5a），并由CAD/Art打印在光掩模上。在硅晶圓上制備SU8-2050負(fù)性光刻膠模具，通過紫外線照射和隨后的顯影（SU-8顯影液）。將固化劑添加到PDMS基材至終濃度為10%（w/w），混合，倒入模具上。真空脫氣后，將模具在65°C下孵育5小時(shí)。然后剝離PDMS，用活檢打孔。PDMS的結(jié)構(gòu)化面通過將兩個(gè)部分暴露于配備Equinox的氧等離子體中，與玻璃顯微鏡載玻片結(jié)合。微流控芯片用Aquapel處理，然后用HFE-7500油處理。

免責(zé)聲明：文章來源網(wǎng)絡(luò)  以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。