20世紀70年代，斯坦福大學的Stanley Cohen與加州大學的Herbert Boyer通過重組質粒的方式，首次將異源基因成功轉移到大腸桿菌中表達，這次DNA重組實驗標志著基因工程技術的誕生，也開啟了重組蛋白光輝璀璨的歷史發展。1976年，Boyer等人創立了第一家基因工程公司基因泰克；1982年，基因泰克研發出世界上第一個利用基因重組技術表達的蛋白——重組人胰島素。時至今日，重組蛋白已經在我們的生活中扮演著不可或缺的角色，其產品種類眾多，被廣泛應用于醫療、食品、化工、科研試劑等諸多領域。

目前，重組蛋白微生物細胞工廠主要采用表達元件優化和底盤菌株改造相結合的構建流程。然而，由于生物系統的多層次結構及復雜性，特別是缺乏系統理解基因組未知位點對重組蛋白合成及分泌的影響機制，現有的底盤菌株改造仍主要依賴于“試錯”方法，開發周期長、成本高、產品生產效率低。因此，如何在全基因組范圍內快速、高效地挖掘蛋白分泌關聯基因位點是提高微生物蛋白細胞工廠設計效率的重要研究方向。

近日，清華大學化工系生物育種技術與裝備團隊和江南大學糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心白仲虎團隊合作，在代謝工程領域國際知名期刊Metabolic Engineering上發表了題為“CRISPRi-microfluidics screening enables genome-scale target identification for high-titer protein production and secretion”的文章，論文通訊作者為清華大學張翀和江南大學劉秀霞。文章提出了“CRISPRi-微流控篩選”策略（圖 1），通過建立全基因組規模CRISPRi文庫，結合高通量的分泌蛋白表征技術和液滴微流控篩選平臺，在新興的重組藥物蛋白表達宿主——谷氨酸棒桿菌中繪制了蛋白分泌的基因型-表型關聯圖譜，系統地揭示了其基因組中能夠用于改善分泌蛋白生產的基因位點，并最終指導構建了高效分泌重組蛋白的底盤菌株。

圖1 CRISPRi-微流控篩選的概述圖 谷氨酸棒桿菌是一種用于生產具有經濟價值的蛋白的新興宿主生物。近年來，谷氨酸棒桿菌被廣泛應用于重組藥物蛋白的生產，由味之素公司開發的谷氨酸棒桿菌表達系統CORYNEX已成功商業化進入市場。在這項研究中，研究團隊首先設計構建了谷氨酸棒桿菌中的第一個全基因組規模CRISPRi文庫，以46549條sgRNA實現對基因組99.71%蛋白質編碼基因和85.36%非編碼基因的遺傳擾動；以納米抗體VHH作為模式分泌蛋白，使用建立的液滴微流控平臺對文庫中超過50萬個單細胞進行了篩選。

通過三輪分選文庫的基因型分析，研究團隊繪制了谷氨酸棒桿菌蛋白分泌的基因型-表型關聯圖譜（圖 2），揭示了包括氧化還原調控、氨基酸代謝、ABC轉運體等生物過程中存在大量提高分泌蛋白產量的潛在靶點。

圖2 谷氨酸棒桿菌蛋白分泌的基因型-表型關聯圖譜

此外，研究人員通過重構實驗與表型性能評價明確了24個可以提高VHH產量的有效基因靶點，其中，抑制8個氨基酸代謝途徑中的基因靶點使VHH產量提高了8.8%~48.1%，抑制8個ABC轉運體相關基因使VHH產量提高了4.3~48.1%；揭示了氧化還原相關轉錄因子是影響谷氨酸棒桿菌分泌蛋白產量的重要基因位點，并通過氧還轉錄因子CosR和RshA的組合敲除構建了 VHH產量提高2.78倍的底盤菌株，并用于I型骨膠原前肽和單鏈可變區片段scFv的高效分泌生產（圖 3）。

圖3 氧還轉錄因子工程構建高效蛋白分泌菌株

值得注意的是，這項研究中利用的高通量篩選平臺是以雙砷-四半胱氨酸反應為基礎設計的，其處理通量可達到》?105個單細胞/天。通過反應體系和操作流程的優化，成功在皮升級液滴水平建立了非酶依賴的分泌蛋白產量表征方法。

圖4 基于雙砷-四半胱氨酸反應的液滴微流控篩選平臺，紅色虛線內為三次微流控操作及相應的實拍圖

由于CRISPR技術和基于雙砷-四半胱氨酸反應的液滴微流控篩選平臺的普適性，該研究中的“CRISPRi-微流控篩選”平臺未來或被廣泛應用于各種原核宿主和不同蛋白的分析，助力下一代微生物蛋白細胞工廠的創制。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004

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