摘要：液滴微流控技術在微納米尺度上對多種流體的流動進行精確控制，從而能夠以高通量的方式生成結構可調(diào)和成分可控的微納米液滴。通過結合合適的水凝膠材料和制造方法，可以將單個或多個細胞高效地封裝進水凝膠中，制備細胞凝膠微球。細胞凝膠微球可以為細胞的增殖、分化等提供一個三維的、相對獨立可控的微環(huán)境，在三維細胞培養(yǎng)、組織工程與再生醫(yī)學、干細胞研究和單細胞研究等生命科學領域具有重要價值。本文主要綜述了基于液滴微流控技術的細胞凝膠微球的制備及其在生物醫(yī)學領域的應用，并對未來的研究工作提出了展望。

1 液滴微流控

微流控技術是一種可以在微納米尺度上處理和操控少量液體(10–9?10–18 L)系統(tǒng)的技術，基于微流控技術的裝置稱為微流控芯片，具有微型化、集成化等特點。液滴微流控是指通過微通道內(nèi)互不相容的多相流體生成離散的液滴，并對其進行操控。基于微流控技術生成的液滴具有單分散性好、無交叉污染、可重復性高等優(yōu)點，廣泛應用于生物、化學、物理等多個學科領域，成為微流控領域的一個重要分支。

生成液滴的方法和技術有很多種，根據(jù)液滴生成過程中是否施加外部能量，可以分為被動法和主動法。被動法生成液滴，是指利用不同的微通道結構使不混溶的分散相和連續(xù)相流體在通道連接處相遇，通過調(diào)節(jié)通道結構、兩相流速大小及流速比，可以在通道連接處下游生成大小可控的液滴。根據(jù)通道幾何形狀的不同，被動法生成液滴(表 1)又可以分為T型通道法(T-junction)、流聚焦法(flow-focusing)和共軸流法(co-flow)。主動法生成液滴是指在液滴生成過程中，通過局部施加電場力、磁場力和離心力等外力控制液滴的生成(表 2)。

表 1 被動法生成液滴的特點和微通道結構簡圖

表 2 主動法生成液滴的原理和特點

近年來，液滴微流控技術的發(fā)展主要體現(xiàn)在以下幾個方面：在芯片制造方面，由于新材料的不斷引入和技術的進步，微流控芯片經(jīng)歷了由硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)到紙基材料的變化；在液滴生成動力學方面，深入研究了液滴的生成原理，即液滴通常是在被動的流體壓力或主動的外部驅(qū)動下生成的，了解其獨特的流體動力學可以對液滴及液滴界面進行精確控制，也使得設計新穎的液滴微流控系統(tǒng)來生成和操縱具有不同結構和功能的液滴成為可能；在應用方面，隨著理論和技術的進步，液滴微流控在微反應器、組織工程與再生醫(yī)學、藥物輸送、人工細胞、腫瘤免疫療法和單細胞研究等諸多領域均占據(jù)了重要的一席。

2 細胞凝膠微球的制備

液滴微流控技術能夠以高通量的方式制備大小、成分和功能可控的單分散液滴，這些液滴可以封裝一種或多種細胞，作為模板來制備具有特定理化性質(zhì)且能夠抗剪切應力的細胞凝膠微球。用來進行封裝細胞的水凝膠材料種類繁多，主要可以分為兩大類：一類是天然高分子，包括海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、纖維蛋白原和多肽等；另一類是合成聚合物，包括聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、聚丙烯酸(polyacrylic acid, PAA)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)等。天然高分子具有良好的生物相容性和可降解性，合成聚合物在機械性能和生化信號的可控性方面具有優(yōu)勢，因此，實際應用中通常采用混合水凝膠，結合二者的優(yōu)勢，能夠為細胞提供可控的微環(huán)境和必要的錨定位點，并調(diào)控細胞的生命活動。

在典型的細胞封裝過程中，含有細胞的水凝膠前體溶液經(jīng)過連續(xù)相的剪切，形成一個個單分散液滴，通過觸發(fā)交聯(lián)，形成細胞凝膠微球。微球的尺寸、形狀、孔隙率和機械性能可以通過改變微通道尺寸、兩相流速、水凝膠材料、水凝膠濃度以及交聯(lián)密度等因素來調(diào)節(jié)。根據(jù)封裝細胞的水凝膠材料的不同，制備細胞凝膠微球的交聯(lián)方式各異，主要包括光交聯(lián)、離子交聯(lián)和溫度誘導交聯(lián)等(圖 1)。

圖 1 細胞凝膠微球的制備方式

A：光交聯(lián). B：離子交聯(lián). C：溫度誘導交聯(lián)

2.1 光交聯(lián)

光交聯(lián)通常是在可聚合材料中加入光引發(fā)劑，待生成前體液滴后再將其置于可見光或紫外光的照射下引發(fā)聚合。這一過程發(fā)生速度快，可在數(shù)秒內(nèi)誘導交聯(lián)，液滴穩(wěn)定性好，對細胞的損傷較小，是目前應用最廣泛的交聯(lián)方法之一。光交聯(lián)的關鍵除了光引發(fā)劑的選擇和嚴格控制光引發(fā)劑的濃度與光照時間外，選擇合適的可聚合材料也很重要。目前，可用于構建光交聯(lián)的生物相容性水凝膠材料主要包括透明質(zhì)酸、明膠和殼聚糖等天然大分子以及聚乙二醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酯等合成大分子。Finklea等將人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)包裹在聚乙二醇修飾的纖維蛋白原前體液滴中，液滴在可見光下照射1.6 s即可完成交聯(lián)，形成載hiPSCs的凝膠微球。聚乙二醇修飾的纖維蛋白原水凝膠顯示出優(yōu)異的生物相容性和機械性能，載hiPSCs凝膠微球在誘導分化第8天即可分化為心臟組織，該工程化心臟組織呈現(xiàn)自主收縮功能，并保持自發(fā)收縮長達3年以上，能夠?qū)λ幚韺W和電刺激產(chǎn)生反應。

2.2 離子交聯(lián)

可用于細胞封裝的離子交聯(lián)水凝膠主要包括海藻酸鹽和殼聚糖，其中海藻酸鹽是研究最多的材料之一。海藻酸鹽對二價陽離子(如Ca2+)有很強的親和力，其帶負電荷的多糖殘基可以與Ca2+發(fā)生離子反應，從而觸發(fā)交聯(lián)，交聯(lián)劑Ca2+的濃度顯著影響海藻酸鹽水凝膠的交聯(lián)度。當Ca2+濃度較高時，形成的海藻酸鹽水凝膠結構比較緊密，特別是水凝膠的外部會直接接觸含有Ca2+的水溶液，從而在接觸瞬間發(fā)生固化。而當Ca2+濃度較低時，固化速度相對較慢，形成的海藻酸鹽水凝膠結構更均勻，具有更高的機械穩(wěn)定性。由于離子交聯(lián)發(fā)生迅速，當液滴形成和凝膠化同時進行時，容易導致微通道堵塞以及凝膠化不均勻，因而Utech等以鈣-乙二胺四乙酸(Ca-EDTA)絡合物的形式提供Ca2+。他們將Ca-EDTA絡合物水溶液與多肽(Arg-Gly-Asp, RGD)修飾的海藻酸鹽水溶液均勻混合作為分散相，此時由于Ca2+與EDTA絡合，Ca2+不會與海藻酸鹽發(fā)生交聯(lián)。當液滴形成后，通過向連續(xù)相中添加低濃度的乙酸降低液滴中的pH，使得Ca-EDTA絡合物發(fā)生解離并釋放出Ca2+，進而引發(fā)交聯(lián)。Utech等利用該方式制備了包裹間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的海藻酸鈣凝膠微球，可以觀察到微球中的MSCs在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定增殖，培養(yǎng)至第15天時細胞存活率仍保持在70%以上。

2.3 溫度誘導交聯(lián)

溫敏材料通常都是通過分子間的氫鍵、疏水作用、范德華力以及π-π作用等較弱的相互作用而形成的，溫度的改變會影響或破壞這些作用，從而使凝膠狀態(tài)發(fā)生改變。故可以通過調(diào)節(jié)外界溫度，觸發(fā)對溫度敏感的水凝膠發(fā)生交聯(lián)。可用于細胞封裝的溫度敏感性水凝膠主要包括膠原蛋白、瓊脂糖、明膠和殼聚糖等天然大分子。此外，還可以通過在天然水凝膠上修飾人工合成基團，比如在殼聚糖上修飾PEG或PVA大分子，進一步優(yōu)化水凝膠的溫度敏感性、溶解性和機械性能。已知膠原蛋白處于4 ℃時是液體狀態(tài)，而當溫度上升到37 ℃時則轉變?yōu)槟z態(tài)。基于此，Kukla等在4 ℃環(huán)境下將原代人肝細胞(primary human hepatocyte, HPP)重懸于Ⅰ型大鼠尾膠原蛋白溶液中，借助流聚焦型液滴微流控芯片生成了包裹HPP的膠原蛋白前體液滴。收集液滴并將其置于37 ℃環(huán)境下孵育以促進膠原蛋白凝膠化，最終形成平均直徑在267.4 μm左右的“微組織”。這種“微組織”不僅可以作為3D人體肝臟模型用于臨床前藥物開發(fā)，還可以通過與不同細胞共培養(yǎng)來研究肝臟疾病中細胞-細胞和細胞-細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)之間的相互作用。

細胞凝膠微球在生物醫(yī)學領域的應用

人體內(nèi)的細胞存在于由蛋白質(zhì)和多糖組成的復雜三維微環(huán)境—ECM中，天然的ECM是一種動態(tài)的、層次分明的物質(zhì)，它不僅是細胞的結構基礎，也是觸發(fā)和調(diào)節(jié)細胞行為的生化和生物物理因素的來源。然而，現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)大多是建立在二維培養(yǎng)皿培養(yǎng)的基礎上，這種二維培養(yǎng)難以真實地反映細胞的體內(nèi)微環(huán)境。水凝膠具有高含水量、生物相容性、降解性和多孔性等與天然ECM相似的獨特性能，并且可以方便地調(diào)整其組成、結構、機械性能和生化性能，因而其作為一種人工ECM在生物醫(yī)學領域發(fā)揮著重要的作用。基于液滴微流控生成的細胞凝膠微球呈三維多孔結構，粒徑通常在60?200 μm之間，其多孔結構和高表體比有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的輸入以及代謝廢物的輸出，能夠使細胞在保持高活力的同時免受周圍微環(huán)境的影響。此外，還可以在水凝膠中加入適宜的生長因子，構建能夠控制細胞生長、增殖和分化的人工ECM，生長于其中的細胞可以很好地與包裹它的水凝膠相互作用，因而這是一種有前途的體外三維細胞培養(yǎng)平臺。本節(jié)主要討論三維細胞凝膠微球在組織工程與再生醫(yī)學、單細胞研究、腫瘤疫苗等領域的應用(圖 2)。

圖 2 細胞凝膠微球在生物醫(yī)藥領域的應用

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