近日，中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心研究員孫佳姝團(tuán)隊(duì)和中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心教授張少華等合作，開發(fā)了新型微流控脈沖過濾技術(shù)與高靈敏熱泳檢測平臺，實(shí)現(xiàn)了全血樣本中腫瘤細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicle，EV）的高效分離分析并用于乳腺癌早期診斷。相關(guān)研究成果以Cascaded microfluidic circuits for pulsatile filtration of extracellular vesicles from whole blood for early cancer diagnosis為題，發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》（Science Advances）上。

細(xì)胞外囊泡（EV）是脂質(zhì)雙層封閉的生物顆粒，直徑為30至250nm，由大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞（尤其是腫瘤細(xì)胞）主動分泌到周圍環(huán)境中，并在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用（1-53）。腫瘤衍生的EV（tEV）攜帶反映細(xì)胞起源分子特征的蛋白質(zhì)和核酸的有效載荷，并且在血液等體液中大量發(fā)現(xiàn)。因此，電動汽車被認(rèn)為是液體活檢生物標(biāo)志物的有前途的來源，用于早期癌癥診斷和腫瘤發(fā)展的實(shí)時監(jiān)測（4-9）。然而，電動汽車分析的一個主要障礙是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、自動化和可重復(fù)的方法來分離和純化電動汽車。為了從全血樣品中分離EV，包括超速離心（UC）在內(nèi)的順序離心現(xiàn)在是金標(biāo)準(zhǔn)，涉及多個離心步驟以去除血細(xì)胞，細(xì)胞碎片和其他干擾物質(zhì)（6，10，11）。整個工作流程既費(fèi)時又費(fèi)力，需要使用多種專用儀器。此外，較長的UC周期可能導(dǎo)致具有蛋白質(zhì)聚集體共沉淀的EV產(chǎn)量低（12，13）。其他幾種分離方法，如基于聚乙二醇（PEG）的沉淀、體積排阻色譜、免疫親和捕獲和微流體分離，已被應(yīng)用于分離EV，在形態(tài)、純度和產(chǎn)量方面具有不同的結(jié)果（14-21）。因此，迫切需要開發(fā)高性能、快速、集成且具有成本效益的電動汽車與生物體液隔離技術(shù)。

膜過濾是通過使用微/納米多孔膜作為尺寸排阻過濾器（尺寸排除過濾器）對EV進(jìn)行尺寸選擇性分離的替代策略（22，23）。據(jù)報道，集成了多個具有不同膜孔徑的過濾器模塊的外泌體全分離芯片可從血漿和尿液中分離出尺寸范圍為30至200nm的EV（24）。包含兩個納米過濾器的離心微流體裝置允許在30分鐘內(nèi)從尿液中自動富集尺寸小于600nm的EV（25）。對于這些死角過濾設(shè)備，膜污染是一個主要問題，會導(dǎo)致性能下降，電動汽車回收率降低。此外，死端過濾中的高壓和剪切力可能會對EV（造成損壞26，27）。為了減少過濾器堵塞，設(shè)計了一種雙膜過濾方法，結(jié)合諧波振蕩，通過在膜表面周圍定期重懸EV從尿液樣本中提取EV（14）。然而，高頻振蕩（3至7kHz）的應(yīng)用幾十分鐘可能會改變EV（的大小和完整性28，29）。此外，對復(fù)雜的外部控制系統(tǒng)的需求可能會限制膜過濾在臨床應(yīng)用中的廣泛使用。

在這里，我們設(shè)計了級聯(lián)微流體回路，用于直接從全血樣本中對EV進(jìn)行脈沖過濾（圖1A）。該平臺由一個安裝有外部聚碳酸酯（PC）膜過濾器（孔徑為600nm）的細(xì)胞去除電路和一個帶有陽極氧化鋁（AAO）膜過濾器（孔徑為20nm）的EV隔離電路組成。在電路類比的基礎(chǔ)上，設(shè)計的微流體回路可以產(chǎn)生通過多孔膜的脈動流，將顆粒從表面抬離，從而抑制過濾器結(jié)垢和顆粒聚集（圖1A）。微流體脈動過濾可在 30 分鐘內(nèi)快速、高產(chǎn)、高純度地分離非轉(zhuǎn)移性乳腺癌 （NMBC） 血液樣本中的 EV。通過一步法PEG增強(qiáng)型熱泳適體傳感器（pTAS）在不到15分鐘的時間內(nèi)測量分離EV的蛋白質(zhì)譜，以診斷NMBC。

腫瘤EV是腫瘤細(xì)胞主動分泌到外周血等體液環(huán)境中的納米尺度（30-250 nm）磷脂囊泡，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。發(fā)展簡單、快速、高效且標(biāo)準(zhǔn)化的EV分離分析方法，已成為腫瘤液體活檢領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)問題。

本工作利用流路-電路類比設(shè)計策略，制備了集成微通道（電阻）、彈性薄膜（電容）、單向閥（二極管）等元件的微流控脈沖過濾系統(tǒng)。該系統(tǒng)僅需使用單向脈沖氣壓驅(qū)動，便可產(chǎn)生可往復(fù)穿過多孔濾膜的微升級脈沖流，從而抑制濾膜堵塞和顆粒堆積，有效提升過濾效果。通過級聯(lián)600納米孔徑濾膜（用于血細(xì)胞去除）和20納米孔徑濾膜（用于游離蛋白、游離核酸、脂蛋白等干擾物去除），該方法可在30分鐘內(nèi)從全血樣本中高效完整地分離純化EV，回收率高達(dá)80%?？蒲腥藛T進(jìn)一步利用PEG增強(qiáng)熱泳的核酸適體傳感平臺，在15分鐘內(nèi)一步法高靈敏檢測EV攜帶的腫瘤相關(guān)蛋白，實(shí)現(xiàn)了早期乳腺癌患者精準(zhǔn)診斷，準(zhǔn)確率達(dá)91%。

研究工作得到中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、中科院穩(wěn)定支持基礎(chǔ)研究領(lǐng)域青年團(tuán)隊(duì)計劃、國家自然科學(xué)基金和國家重點(diǎn)研發(fā)計劃等的支持。

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