1.2 物理特性富集法

物理特性富集法根據(jù)物理性質(zhì)來分離CTC，包括大小、密度、力學(xué)和介電性質(zhì)。從大小上來看，CTC的直徑約為10-20μm，而血細胞大小為7-12μm，通過過濾可留下體積較大的CTC。從密度上來看，CTC的密度較白細胞和紅細胞密度小，通過密度梯度離心可實現(xiàn)CTC分離。除了大小和密度的差異，一些技術(shù)也利用CTC和血細胞之間的力學(xué)和介電性質(zhì)差異來捕獲CTC。具體來說，CTC的可變形性不及血細胞。另外，CTC的膜電容通常較血細胞低，在一定強度的電場中，其遷移率與血細胞會產(chǎn)生差異。微流控技術(shù)除了在親和性富集法中有廣泛應(yīng)用外，在物理特性富集法中也有應(yīng)用。微流控芯片根據(jù)CTC與血細胞物理特性的差異，通過在芯片中設(shè)置不同的微結(jié)構(gòu)單元將其從血液中分離出來，常用的微結(jié)構(gòu)包括微孔、微過濾網(wǎng)和微柱等。

1.3 生化和物理特性相結(jié)合的方法

此外，也有一些技術(shù)將CTC的物理和生物化學(xué)特性結(jié)合起來用于CTC富集。如CTC-iChip，其基于CTC大小和表面標(biāo)志物的表達情況進行CTC富集。該技術(shù)首先根據(jù)細胞大小，將較小的紅細胞和血小板過濾出去，留下白細胞和腫瘤細胞。然后，用識別EpCAM的磁珠偶聯(lián)抗體對CTC進行免疫染色，在磁場中捕獲并收集在芯片上。或者用識別CD45的磁珠偶聯(lián)抗體去除白細胞后收集CTC。

生化和物理特性相結(jié)合的富集法（以CTC-iChip為例）

二CTC富集技術(shù)的發(fā)展歷程和趨勢

2.1 發(fā)展歷程

從技術(shù)發(fā)展史來看，CTC富集技術(shù)分為三代：第一代為基于物理特性的粗分離技術(shù)，第二代為基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)，第三代為基于物理或生化特性的微流控芯片技術(shù)。

2.1.1 基于物理特性的粗分離技術(shù)

基于物理特性的粗分離技術(shù)通過特殊濾膜裝置、密度梯度離心將CTC分離出來。這些技術(shù)操作簡單成本低廉，不依賴細胞表面抗原的表達，捕獲的細胞數(shù)量多，但是由于CTC物理特性的異質(zhì)性，難以富集到高純度的CTC。

基于物理特性的粗分離技術(shù)

2.1.2 基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)

基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)通過免疫磁珠偶聯(lián)的抗體或多肽正向或負向篩選出CTC。由于技術(shù)的限制，早期的磁珠只能達到微米級。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在使用的磁珠大都為納米級，其增大的比表面積增加了與待測細胞的接觸幾率，更好的分散性降低了對細胞造成的機械性壓力，大大提高了CTC的富集率。最典型的基于免疫磁珠富集CTC的技術(shù)平臺是強生子公司veridex的CellSearch，其是全球目前唯一同時經(jīng)過FDA和CFDA批準的用于CTC檢測的商業(yè)化產(chǎn)品。該產(chǎn)品由于檢測靈敏度不高，且無法分離活體CTC，2016年初已停產(chǎn)。除了CellSearch之外，也有多種技術(shù)平臺基于免疫磁珠技術(shù)捕獲CTC，如AdnaGen公司（已被Qiagen收購）的AdnaTest，Miltenyi公司的MACS，Illumina公司的MagSweeper。

用于CTC檢測的CellSearch平臺。（A）將血液吸入含有EDTA和細胞保護劑的CellSave保護管中;（B）將7.5mL血液轉(zhuǎn)移到單獨的管中并離心以分離固體血液成分和血漿;（C）樣品放入CELLTRACKS?AUTOPREP? 系統(tǒng)中，吸出血漿并將樣品重懸于緩沖液中;（D）添加偶聯(lián)EpCAM抗體的磁性納米顆粒并與EpCAM陽性細胞結(jié)合，從而“富集”上皮來源的CTC。然后將磁珠結(jié)合的細胞與其他細胞通過磁性分離;（E）CTC用CK8，CK18和CK19抗體染色。CD45陽性染色細胞被認為是白細胞，并被排除在分析之外;（F）應(yīng)用DAPI染色細胞核;（G）施加磁力以分離磁珠結(jié)合的EpCAM陽性細胞;（H）CK陽性、DAPI陽性、CD45陰性的細胞被認為是CTC用于進一步分析。

2.1.3 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)基于CTC的物理特性或生化特性或兩種特性的結(jié)合來富集CTC，所需樣品量小、流速可控而且能夠捕獲活細胞。微流控芯片技術(shù)目前已經(jīng)歷了三代的發(fā)展過程：第一代芯片為以CTC-Chip為代表，第二代芯片以HB-Chip為代表，第三代芯片以CTC-iChip為代表。

微流微柱富集：該類芯片基于CTC與血細胞生化特性的差異，在芯片中設(shè)置微柱陣列將其從血液中分離出來。此類芯片以CTC-Chip為代表，該芯片是第一個使用微流體技術(shù)富集CTC的裝置。CTC-Chip由78,000個微柱陣列組成，微柱被識別EpCAM的抗體包被，微柱的幾何排列和流體流速被優(yōu)化以促進細胞附著到抗體包被的柱上。除了CTC-Chip，也有一些公司開發(fā)基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片富集CTC，如Captura公司的GEDI-Chip，Biocept公司的OncoCEE。基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片由于復(fù)雜的微柱設(shè)計很難在大規(guī)模的基礎(chǔ)上進行高通量生產(chǎn)。此外，目前用于CTC檢測和表征的技術(shù)嚴重依賴于免疫細胞化學(xué)和需要高分辨率成像的其他技術(shù)，這在非透明三維微柱陣列的存在下是困難的。

第一代芯片CTC-Chip

微流表面富集：由于基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片的局限性，表面捕獲的微流體芯片被開發(fā)，這些芯片使用抗體包被的表面裝置捕獲CTC。表面捕獲裝置的簡化架構(gòu)更適合于大規(guī)模生產(chǎn)，并且還允許制造更易于成像的透明裝置。此類芯片以HB-Chip為代表，其微流道的結(jié)構(gòu)為魚骨形（HB），表面被識別EpCAM的抗體包被，血液流過一個可視通道，通道內(nèi)魚骨形溝回能夠引起血液的一個輕微斡旋，從而增強了其與抗體修飾表面的接觸。與第一代CTC芯片相比，第二代的HB芯片制作更為簡單，且可更高效地捕獲腫瘤細胞，捕獲效率約90%。后人在第二代的基礎(chǔ)上加上了aptamer（結(jié)合CTC表面的EpCAM），進一步提高了CTC的捕獲效率。除了HB-Chip，GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的ModularSinusoidal Microsystem也都采用表面裝置捕獲CTC。使用表面捕獲裝置的一個挑戰(zhàn)是下游處理的靈活性，捕獲的CTC被固定在裝置的表面上，并且難以恢復(fù)以進行進一步分析。在胰蛋白酶消化后可以釋放在這些裝置中捕獲的細胞，然而胰蛋白酶很可能切割用于后續(xù)分析的許多感興趣的表面受體。

第二代芯片HB-Chip

微流免疫磁珠富集：目前已經(jīng)有多家公司或研究單位應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)來解決表面捕獲裝置的局限性，該技術(shù)能很好地控制細胞捕獲與釋放。此類芯片以CTC-iChip為代表，該芯片將免疫磁珠和微流控技術(shù)結(jié)合起來用于CTC富集。CTC-iChip首先使用塑料微柱陣列將小個的紅細胞和血小板過濾出去，然后在磁場中通過“慣性聚焦”作用將較大的細胞排成一行，并使用陽性或陰性富集方法分離CTC與白細胞。CTC-iChip的捕獲效率可以高達98%，但是對于直徑較小（<8微米）的CTC并不適用。除了CTC-iChip，也有多種芯片技術(shù)使用免疫磁珠富集CTC。如Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy，F(xiàn)luxion公司的Isoflux，這些芯片的捕獲效率與第二代芯片相近，為90%左右。

上述芯片主要基于CTC的生化特性將其從血液中分離出來，具有特異性高的優(yōu)點，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細胞。目前大部分技術(shù)采用EpCAM作為CTC的表面特異性抗原，但是在不同的腫瘤亞型中，EpCAM的表達各不相同。依賴EpCAM的CTC分選芯片會丟失不表達或低表達EpCAM的CTC，然而這些CTC具有更大的浸潤性和侵入性。因此，缺乏公認的表面標(biāo)志物限制了親和性富集在CTC分選中的應(yīng)用。

為了無需依賴表面標(biāo)志物，也有一些微流控芯片基于物理特性富集CTC，目前主要有基于細胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)，基于細胞力學(xué)性質(zhì)的芯片技術(shù)和基于細胞介電性質(zhì)的雙向電泳技術(shù)。

基于細胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)：該技術(shù)通過在芯片內(nèi)部設(shè)計不同的小于CTC直徑的微孔、微過濾網(wǎng)、微柱等結(jié)構(gòu)，當(dāng)含有CTC的樣品流經(jīng)芯片時，CTC由于直徑大而被卡在結(jié)構(gòu)內(nèi)，血細胞則隨緩沖液一起流出，較大的白細胞被結(jié)構(gòu)捕獲時，由于CTC比白細胞變形性小，加大緩沖液流速時，白細胞被沖走，CTC則留在芯片內(nèi)，從而達到分離目的。Abnova公司的ClearCell?CXSystem就是基于此原理分離CTC的代表，該系統(tǒng)還可以動態(tài)監(jiān)測CTC的捕獲過程。芯片主要結(jié)構(gòu)由圓柱形微柱構(gòu)成，每個捕獲單元由三個圓柱排列組成一個“爪形”結(jié)構(gòu)。

基于細胞大小和變形性差異分選CTC的優(yōu)勢在于：操作過程簡單，捕獲效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量富集，成本遠遠低于CellSearch，無需依賴表面標(biāo)志物，分選出的CTC可以用多種抗體進行標(biāo)志物鑒別。該方法存在的問題是僅僅基于細胞尺寸和變形性不同而進行過濾式分選，由于CTC尺寸和白細胞有重疊部分，CTC有可能會通過濾網(wǎng)或微柱的間隔；而且在較大的機械力作用下，CTC隨著緩沖液流過微柱或者濾網(wǎng)時容易破裂。這些因素會對分離純度和細胞活性造成一定影響，這類芯片在設(shè)計內(nèi)部捕獲單元時應(yīng)避免使用帶棱角的微柱，比如三角形、長方形、正方形等。

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