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液滴微流控PCR的應用

液滴微流控PCR在技術方面的迅速發展已經證明了該技術的優越性并被廣泛地應用于生物、化學等領域,尤其在單分子放大和分析方面的優勢更加明顯。在此,我們將主要介紹該技術在三個重要科學領域的應用。

一、高通量篩選

    近幾十年來,生物學家一直致力于開發高通量篩選的各種技術,以及從較大的文庫中獲得更多功能性的基因和蛋白。其中一種特別的技術是指數富集配體系統進化技術(SELEX),通過篩選獲得針對靶標具有高結合力和高選擇性的DNA或RNA的核酸適配體。但SELEX耗時費力、低效且昂貴。

為了解決上述問題,發展了一種基于瓊脂糖液滴微流控ePCR技術,直接從復雜的單鏈DNA文庫中篩選核酸適配體。該種技術,針對癌癥標志物Shp2蛋白進行篩選獲得DNA富集文庫被系統稀釋并在芯片上被包裹進單個瓊脂糖液滴中,使得每個液滴至多含有一條DNA序列,通過PCR進行放大擴增,產生單克隆的瓊脂糖微球。DNA染色后,含有DNA的明亮微球被挑選出來。利用高通量的熒光流式細胞術,對單克隆微球中的單鏈DNA進行結合力表征。那些具有高結合力和特異性的單鏈DNA序列被挑選出來作為核酸適配體,或者被DNA測序,或者即可直接用于后續的生物醫學實驗。該方法還可以進一步推廣應用其他分子進行技術,如mRNA展示、噬菌體展示等等。

二、下一代DNA測序

     DNA測序已被廣泛地應用于診斷學、生物技術、法醫生物學、生物信息學的領域。為了將DNA測序技術真正應用于人類日常的醫學診斷和醫療保健,高準確性、長程連續性、高通量及低成本依舊是必須解決的問題,也是科學家發展下一代測序技術的主要目標。其中,消除傳統的克隆技術DNA文庫準備法是下一代測序發展的首要解決問題。后來發展了一種高通量的SCGA技術,并證明了它在DNA測序方面的應用。芯片上可以很容易地產生一種高通量的SCGA技術,并證明了它在DNA測序方面的應用。與BEAMing技術中小磁珠和小液滴相比,大磁珠具有更大的表面積可以標記上足夠多的正向引物,同時反向引物等其他PCR試劑的含量也達到10倍過量,保證了PCR的效率。

    三、稀有突變的定量靈敏檢測

基因改變,例如刪除、定點突變和重組等,在癌癥的發生和發展中起著重要的作用,也被認為是癌癥診斷中的生物標記物。腫瘤細胞中的突變是細胞釋放到血液、淋巴和尿液中,就要求這些突變的檢測常常要在大量正常細胞釋放的非突變DNA的高背景下進行。因此,一種能夠利用臨床樣品,進行簡單、高靈敏、定量檢測突變型和野生型比例的方法是非常必要的。

針對這些低頻基因突變的檢測,為獲得統計學上有意義的數據,必須進行高通量的分析。利用高通量微乳產生陣列定量檢測致病菌。磁珠表面被標記上了針對不同基因的多種正向引物用于液滴PCR。最終通過實驗得出,當使用96管道的MEGA時,5分鐘內即可產生包含104細胞量的液滴。最終,該方法的檢測限達到3/105,準確度高99%。這些結果證明了高通量的微流控平臺可以在復雜體系中實現單分子和單細胞水平的定量基因型研究。

另一種液滴微流控PCR方法,應用于高背景下的靈敏定量檢測突變DNA。后來設計了另一種液滴數字PCR體系,并證明了在10萬個野生型基因背景下的單個突變型靈敏檢測。他們更進一步提出了在血漿中的循環DNA的絕對定量檢測方法。因此,這些高靈敏度的定量方法還可被應用于其他復雜體系的檢測,如傳染病的檢測、等位基因的鑒定、基因翻譯的分析等等。


 微流控

       液滴微流控技術極大地改變了傳統的PCR技術,尤其是在單分子DNA擴增放大方面。微流控技術保證了對液滴尺寸和組分的嚴格控制,也可以獨立地對每一個液滴進行混合、傳遞、和分析等操作。其次,由于在微尺度上的高比表面積,液滴可以減少熱量和物質傳遞的時間,加快PCR反應,有利于快速的醫學診斷和野外檢測。再次,作為載體的郵相可以很好地阻斷液滴內樣品與管道壁的接觸,避免了液滴間的交叉污染、模板損失和PCR偏好。此外,一次試驗中能快速地產生大量均勻相同的液滴,從而可在短時間內完成大規模的平行實驗和反應,并具有很好的重現性和單分子定量分析的能力。雖然液滴微流控PCR的發展和應用還剛剛起步,它已經在單分子PCR放大方面展現出了巨大的潛能,未來應向著更為精巧和多功能的方向發展,例如系統的集成、裝置的設計優化、裝置的制造、以及系統的自動化等。



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