資料來源：遺傳, 2019, 41(7): 611-624 doi: 10.16288/j.yczz.19-051

病原微生物的快速檢測對疫情的預(yù)防控制至關(guān)重要。近年來,微流控技術(shù)與核酸等溫擴增技術(shù)相結(jié)合,誕生了多種病原微生物等溫擴增微流控檢測技術(shù)。該技術(shù)實現(xiàn)了病原微生物核酸提取、擴增與檢測一體化,并具備多重檢測、定量檢測等功能,具有對儀器依賴度小、對操作人員要求不高、樣本量需求小和自動化程度高等優(yōu)點,適合于在多種環(huán)境下的病原微生物快速檢測。本文將對目前基于核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)進行簡述，以期為病原微生物的快速篩查提供更多的方案思路。

一、基于重組酶聚合酶擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

2006年,Piepenburg等首次提出了重組酶聚合酶擴增反應(yīng)(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重組酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和單鏈結(jié)合蛋白(gp32)以及兩條特異性的上下游引物參與的等溫擴增。首先,T4 uvsX在輔助因子uvsY的作用下與引物結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合物,然后該復(fù)合物尋找與靶標DNA的互補區(qū)域進行雜交并置換下另一條單鏈,置換下的單鏈馬上被gp32結(jié)合防止其再與互補鏈雜交,最后T4 uvsX在ATP的作用下與引物解離,聚合酶Bsu與引物結(jié)合并沿模板進行延伸(圖1)。該反應(yīng)在37~42℃下30 min內(nèi)可以獲得10的12次方拷貝的擴增產(chǎn)物,其靈敏度可達到單拷貝,其擴增產(chǎn)物長度在500 bp以內(nèi)最佳。對RPA產(chǎn)物的檢測可采用包括瓊脂糖凝膠電泳、熒光探針實時檢測、及側(cè)流層析檢測等多種方法。由于RPA反應(yīng)快速、靈敏以及恒溫條件溫和等特點,因此易于與微流控芯片結(jié)合開發(fā)出對病原微生物的即時檢測(point-of-care testing, POCT)技術(shù)。

圖1   重組酶聚合酶擴增反應(yīng)基本原理

1：在重組酶作用下,引物與靶序列結(jié)合;2：引物與靶序列結(jié)合后置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合;3：在聚合酶作用下進行延伸,同時置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合;4：同源雙鏈分離,持續(xù)延伸;5：形成新的雙鏈,并進行下一個循環(huán)。參考文獻[10]修改繪制。

二、基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi等于2000年首次發(fā)表,該反應(yīng)原理如圖2所示。針對待測靶標設(shè)計一對外引物F3、B3和一對內(nèi)引物FIP、BIP,在具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)作用下,引物沿模板發(fā)生延伸和鏈置換反應(yīng),產(chǎn)生長短不一的靶標重復(fù)片段,該反應(yīng)通常在60~65℃進行,1 h內(nèi)將待測靶標擴增109倍以上,靈敏度可達到檢測10拷貝的待測靶標。通過額外引入一對環(huán)狀引物可顯著提升其檢測靈敏度并使反應(yīng)時間縮短至30 min內(nèi)。其擴增產(chǎn)物可通過凝膠電泳、雙鏈嵌合染料、比濁法、鈣黃綠素、羥基萘酚藍、pH響應(yīng)顯色、納米金可視化]等方法進行檢測。鑒于LAMP靈敏度高、檢測方式多樣、反應(yīng)速度快等優(yōu)點,近年來發(fā)展了很多LAMP微流控芯片,它們在進樣方式、產(chǎn)物檢測方法等方面各有千秋,在病原微生物核酸檢測方面均具有較好的應(yīng)用前景。

圖2   環(huán)介導(dǎo)等溫擴增原理

A：LAMP外引物F3/B3和內(nèi)引物FIP/BIP與靶標互補的6個區(qū)域,如其中F3與F3c互補,B3與B3c互補;B：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)物生成步驟,引物FIP通過F2區(qū)域與模板鏈F2c結(jié)合并進行延伸,之后F3與靶標F3c結(jié)合并進行鏈置換反應(yīng),FIP延伸產(chǎn)物被替換釋放,釋放的單鏈末端形成環(huán)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)3)。BIP和B3以相似的方式進行,生成兩端具有環(huán)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物5。C：循環(huán)放大步驟,結(jié)構(gòu)5以自身為模板,從3°末端F1區(qū)域開始自引發(fā)DNA合成,同時FIP退火至環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的F2c區(qū)域并進行延伸得到結(jié)構(gòu)6。結(jié)構(gòu)6以自身為模板延伸,置換下與結(jié)構(gòu)5互補的產(chǎn)物7。結(jié)構(gòu)7到結(jié)構(gòu)8再到結(jié)構(gòu)5與結(jié)構(gòu)5到結(jié)構(gòu)6再到結(jié)構(gòu)7類似。結(jié)構(gòu)9和結(jié)構(gòu)10分別由結(jié)構(gòu)6和結(jié)構(gòu)8生成。在環(huán)狀結(jié)構(gòu)與FIP/BIP引物的共同作用下生成含有多個重復(fù)靶標序列的結(jié)構(gòu)11、12。

三、基于其他核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

1、基于其他核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

滾環(huán)擴增(rolling circle amplification, RCA)是一種具有鏈置換活性DNA聚合酶催化的等溫擴增反應(yīng),需要一條鎖式探針與靶序列雜交后連接成環(huán)狀模板,引物與環(huán)狀模板匹配后在DNA聚合酶作用下沿環(huán)延伸并不斷置換先前產(chǎn)生的延伸鏈,最終產(chǎn)生重復(fù)的長單鏈DNA產(chǎn)物。

2、基于依賴核酸序列擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

1991年,加拿大Cangene Corporation公司Jean Compton實驗室首次提出依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。該方法以單鏈RNA為模板,在恒溫條件下,通過逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制機制對目標RNA進行擴增],90min內(nèi)可以將靶標擴增至10的12次方,其產(chǎn)物長度為100~250 bp,靈敏度可達檢測單個拷貝的靶標分子。

3、基于解旋酶依賴性擴增的病原微生物微流控檢測技術(shù)

在體內(nèi),DNA通過解旋酶、DNA聚合酶及各種輔助蛋白因子進行復(fù)制,Vincent等[49]模仿這一過程開發(fā)出了體外解旋酶依賴性擴增法(helicase-dependent amplification, HDA)。該方法原理是首先DNA雙鏈被DNA解旋酶(E. coli UvrD helicase)分離為單鏈并分別被單鏈結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)結(jié)合,之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交,在DNA聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸,合成新的雙鏈,在37℃條件下反應(yīng)1~2 h可獲得106倍的擴增產(chǎn)物,其靶序列在400 bp范圍內(nèi)可以得到有效擴增。

四、不同技術(shù)比較

核酸等溫擴增技術(shù)因其反應(yīng)條件溫和而倍受病原微生物檢測的青睞。雖然各種核酸等溫擴增技術(shù)在反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件、檢測方式等方面均各有優(yōu)劣(表1),但它們依然離不開核酸提取、擴增與產(chǎn)物分析等步驟,如何簡化與集成這些繁瑣操作步驟成為病原微生物核酸現(xiàn)場快速檢測的關(guān)鍵。微流控芯片與核酸等溫擴增技術(shù)的結(jié)合成功解決了這一問題。

表1   不同核酸等溫擴增技術(shù)比較

相信隨著微流控技術(shù)與核酸等溫擴增檢測技術(shù)的發(fā)展,會出現(xiàn)定量性能更好、儀器依賴度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等溫擴增病原微生物檢測芯片技術(shù),使病原微生物即時檢測向著集成化、快速、高通量、多重篩查的方向發(fā)展。

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