Q1：請問下高通量測序相對基因芯片有何優(yōu)勢？

A：高通量測序有如下優(yōu)點：

1、準確性高，可重復性高；

2、不僅能對已知的基因進行檢測，還能對新基因進行尋找；

3、對基因表達量的檢測限更廣（對高豐度和低豐度基因的檢測更加準確）

4、直接得到基因序列，原始數(shù)據(jù)不會受基因組的版本號變化的影響（芯片原始數(shù)據(jù)為探針信息，可能因為基因組升級導致注釋信息變化而失效）。因此，測序更加適合于實驗室樣本數(shù)據(jù)的長期累積和分析

 

Q2：我想對某種海洋生物的育種進行研究，但該海洋生物的基因組數(shù)據(jù)一直沒有公布，請問是否可以通過轉錄組測序來篩選分子標記？

A：可以，我們通過轉錄組測序可以對樣本個體SSR等分子標記進行檢測。同時，也可以建議老師采用RAD測序來進行分子標記的篩選。

 

Q3：轉錄組測序的取樣時實驗室沒有液氮了，能否將樣品直接至于-80℃冰箱中保存？

A：不能，因為RNA暴露在富含RNA酶的環(huán)境中極易降解，需要迅速至于液氮中，并低溫保存，而冰箱無速凍功能。

 

Q4：沒有基因組的物種，可以憑借轉錄組數(shù)據(jù)做可變剪切的預測么？

A：不能，預測可變剪切需要有參考基因組。

 

Q5：我拿到了我的表達譜測序結題報告，顯示差異基因有好幾千個，請問我怎樣才能找到感興趣的某功能基因？一個一個找嗎？

A：如果老師已經(jīng)鎖定感興趣的代謝通路，可以點開結題報告中kegg富集分析，選擇該代謝通路的超鏈接，打開基因列表，查看該通路中的差異表達基因，如果仍然過多，老師您可以點開路徑名的超鏈接，在路徑圖中選擇位于上游的差異基因。

 

Q6：差異基因的篩選條件為何是在兩個樣品中的表達量相差大于二倍？

A：表達量差異倍數(shù)的設置是根據(jù)老師的研究需要設定的，目的是找到合適數(shù)量的差異基因，并無硬性指標。二倍的差異是國際雜志認可的篩選標準。如果老師認為得到的差異基因數(shù)過多，可以自行提高差異倍數(shù)。具體可以咨詢基迪奧的技術人員。

 

Q7：你們的轉錄組結題報告為何沒有關于mRNA可變剪接的統(tǒng)計結果？

A：對于無參考基因組的物種，轉錄組測序的結果是無法區(qū)分可變剪切和基因家族的，我們不知道兩個相似序列是否來自同一個基因，所以轉錄組測序結果不包含可變剪切的分析。

 

Q8：如何判斷基因表達量測定結果的好壞？

A：有如下方法:一，觀察結題報告中的測序及比對結果是否正常；二，正常情況下兩樣品差異比較得到的上調(diào)基因和下調(diào)基因的數(shù)目應基本在一個數(shù)量級；三，可以通過比較兩樣品中物種組成型表達的基因（看家基因）的表達量，正常情況下應基本一致。我們都會在將結果呈遞給老師前對結果進行檢驗，老師可以放心使用。

 

Q9：我想在ncbi數(shù)據(jù)庫中下載的某物種轉錄組測序結果，請問具體方法是什么？

A：在ncbi數(shù)據(jù)庫中，轉錄組測序的reads信息被壓縮為SRA格式，在ncbi搜索物種，可以在搜索的SRA欄目中找到測序信息和下載鏈接。下載下來的數(shù)據(jù)需要使用SRA轉換工具來轉換成分析軟件需要的FASTQ格式。

 

Q10：我研究的物種沒有參考基因組，一共六個樣品。我準備分別進行混樣轉錄組測序，再進行表達譜測序，你們還有更好的辦法嗎？

A：老師您的方法是合理的，對混樣進行轉錄組測序，盡可能得到完全的轉錄組數(shù)據(jù)，以此為參考序列，進行表達譜測序。但我們有更好的辦法。老師可以選擇對合樣品進行pe100測序，測序量為2G，然后將表達譜測序的結果混合后進行組裝，同樣可以得到轉物種的轉錄組。

 

Q11：我在貴公司進行了測序，現(xiàn)在正在進行論文撰寫，到關于你們的測序方法與結果不甚了解，請問你們能否提供相關幫助？

A：我們有對我們的各業(yè)務線的圖表結果及其實驗分析方法進行了撰寫，并參考在知名sci雜志上發(fā)表的論文對文檔進行了翻譯。老師可以聯(lián)系我們的銷售來獲取這些文檔。

 

Q12：在lncRNA分析中，你們是如何分析其對基因的調(diào)控的？

A：由于目前對lncRNA的功能機制的研究尚未明確，現(xiàn)在我們一般采用lncRNA順式調(diào)控假說的方法原理，將lncRNA附近10kb的區(qū)域中包含的基因作為潛在的lncRNA相關基因，如果同時進行了表達譜測序，我們可以通過這些基因與lncRNA間的共表達關系對之進行篩選，得到更可信的lncRNA與基因調(diào)控網(wǎng)絡。

 

Q13：對于一個未知物種而言，如果做轉錄組denovo項目，一般有多少個unigene比較合適？

A：物種的轉錄組unigene數(shù)目因為物種的不同可能有顯著不同，考慮到每個基因有可能產(chǎn)生多個轉錄本的情況，結合目前的項目經(jīng)驗，一般物種的unigene數(shù)目為基因數(shù)的2-4X比較合適。

 

Q14：計劃研究一個物種（基因組未發(fā)表），想了解一下其基因組的基本信息，請問有哪些途徑？

A：可以通過查詢相關網(wǎng)站數(shù)據(jù)獲知，例如Animal Genome Size Database，PlantGDB,Plant DNA C-values Database等。

 

Q15：對于某個物種，做過兩次獨立的轉錄組組裝，如何知道兩次結果中的unigene的對應關系？

A：可以但是一般老師通常關注的是某類基因，而且老師往往已經(jīng)在一個轉錄組結果中找到，那么可以建議老師通過本地blast，將所要查詢的基因與另一個轉錄組數(shù)據(jù)進行匹配，將對應unigene找出。

 

如果數(shù)量巨大，我們將提供大批量blast的個性化分析服務。

 

Q16：做多個樣本的RNA-seq項目，兩兩比較中有某個樣品的基因表達量上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)目相差很多（兩個數(shù)量級），是否正常？

A：理論上講，一個細胞的RNA總量是比較穩(wěn)定的，那么通常情況下，上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)一般不應該差別很多，如果差別一個數(shù)量級以上，可以考慮查證是否在樣品中存在的rRNA或者其他物種RNA污染的影響。

 

Q17：如果要做一個未知物種的轉錄組高通量測序項目，應該怎么來選擇測序平臺及數(shù)據(jù)量？

A：Illumina測序平臺因其穩(wěn)定的測序質(zhì)量，優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)性價比，占領了市場80%以上的份額。數(shù)據(jù)量我們一般推薦做4-8G（這個也不是固定標準，隨著行業(yè)發(fā)展會變化，而且不同的老師可能有不同的需要）

 

Q18：目前做高通量測序項目是否必須設置生物學重復？

A：理論上講，設置生物學重復是比較合理嚴謹?shù)淖龇ǎ绻蠋煹慕?jīng)費允許的話，可以建議老師做適當?shù)纳飳W重復（至少三個）。但就目前高通量研究領域來看，考慮到成本問題，單獨樣品的研究亦可得到學界的一定認可，比如IF在5以下的期刊，還是可以接受無重復的樣本研究。不過隨著時間的推移，做生物重復是必然趨勢。

 

Q19：老師想打開測序結果文件，但是半天沒反應，是怎么回事？

A：這是因為某些文件較大，office軟件（word，記事本等）通常需要將文件整體讀入電腦內(nèi)存，耗費電腦資源，故速度較慢甚至死機，建議老師可以使用VIM，ultraedit等軟件。

 

Q20：結題報告中某些插件顯示不出來，是怎么回事？

A：這些問題是由于瀏覽器以及java插件的版本兼容問題。但這些東西對于結果的整體解讀不會有很大影響，比如熱圖，這個圖一般不能直接用到文章里，后來可根據(jù)老師挑取特定的基因，重新繪制熱圖。