微液滴中的單細胞包封主要是通過流體動力學和表面張力操縱來實現的。液滴尺寸由連續相的粘度、界面張力、微通道尺寸以及分散相和連續相的流速決定，液滴直徑從幾十微米到幾百微米不等。單細胞微滴具有高通量和小尺寸的特點，使其適用于高通量單細胞分析。然而，單細胞的包封通常是隨機的，特別是當基于通常用于單細胞分析的被動液滴生成方法時。需要加強對單細胞包囊的控制。為了提高實際應用的封裝效率，通常會進行隨機封裝，然后根據工藝要求進行進一步篩選。此外，通道結構經過定制，以確保細胞的最佳排列和封裝。

隨機單細胞包封使用微流體液滴技術生產液滴面臨著一個固有的復雜性，即溶液中細胞的分布通常是不均勻的，包封是一個隨機過程。因此，無限稀釋的細胞懸浮液中每個液滴封裝的細胞數量將遵循泊松分布，其中液滴中的細胞數量由液滴的大小和懸浮液中細胞的密度決定。增加細胞密度或液滴大小會增加給定液滴包封多個細胞的機會。例如，在細胞懸浮液濃度為7.5×105個細胞/mL時，在體積為33、180、320 pL時，含有多個細胞的概率分別為0.03、0.83和2.45%（圖4A）。預測的泊松分布與液滴形成后獲得的實際分布非常一致。一般來說，大多數液滴會有一個細胞或沒有細胞，只有少數液滴會包含多個細胞。隨機確定的包封在液滴內的細胞數量的變化將對研究單個細胞的能力產生重大影響。

在隨機包封方法中，每個液滴的細胞數量取決于細胞懸浮液的初始濃度和液滴體積，但將遵循高度隨機的分布，其中單細胞液滴的比例較低。因此，必須進一步加強控制單個液滴內包封的細胞數量的程度。為了提高單細胞包封的效率，一些研究人員采用了隨機包封后分選的方法。例如，Navi等人提出了一種使用流聚焦微流體裝置在水滴中產生水的方法。87在他們的裝置中，鐵磁流體被集成到全水滴微流體系統中，以實現單細胞包封和空液滴的抗磁性分離。與現有平臺相比，他們的平臺的主要優勢是良好的生物相容性，不會對細胞造成傷害，芯片簡單易操作。通過使用反磁力來操縱細胞包封液滴，液滴不需要被磁化，因此細胞不會與磁性材料直接接觸，從而能夠以100%的分離純度進行未標記的細胞操作。這種簡單且生物相容的微流體平臺非常適用于單細胞分析。此外，Nan等人引入了一種微流體系統來生產和分類單細胞微膠囊（圖4B），88通過該系統，他們能夠在微流體裝置中實現微滴和微凝膠的高通量制備。重要的是，芯片上的分選電極用于完成單細胞微膠囊的選擇，同時將其轉移到培養基中。在每毫升3.05×106個細胞的細胞密度和50μm的液滴直徑下，它們實現了16%的單細胞包封率。分選后，單細胞包封率提高到80%以上。該方法可用于整合液滴凝膠化、單細胞負載微凝膠分選和轉移到培養基中，以實現單細胞水平的高通量分析，從而全面評估細胞異質性。最近，Shum的團隊開發了一種基于微流控液滴和熒光激活分選技術組合的按需液滴收集系統，該系統可以連續定量地將所需的液滴收集到微管中，而不會造成明顯的樣品損失或微流控中斷（圖4C）。具體來說，他們的方法允許在液滴產生后交替地對每個分支通道進行分選、分布和收集，以實現單細胞液滴的連續收集。然后將包封的單細胞液滴有效地捕獲在培養板上，并進一步培養以研究細胞行為并充分分析單個細胞的特異性。通過使用熒光激活液滴分選和閥驅動分配，該方法可以在200 Hz以上的頻率下篩選單個細胞，單個細胞的包封效率和回收率分別為98.5%和99%。這種方法比傳統的人工細胞選擇和激光捕獲顯微切割技術更有效，在單細胞水平分析任務中具有廣闊的應用前景，如免疫學中的細胞因子檢測、蛋白質組學中的質譜和轉錄組的全基因組測序。

受控的單細胞包封如前所述，懸浮液中的細胞隨機包封成液滴的過程結果通常遵循泊松分布，這通常會導致相對較低的單細胞包封率。為了提高單細胞包封效率，可以在彎曲的微通道中使用慣性測序將單個細胞包封在液滴中，通過將慣性力和Dean力均勻地結合到空間細胞的過程。通過將細胞流動的周期性與液滴的產生相匹配，可以減少空液滴和多細胞液滴的數量，提高單細胞的包封效率。例如，Edd等人報道了高縱橫比微通道中液滴對單個細胞的順序包封。在他們的研究中，細胞自組織成兩股均勻間隔的流，單細胞直徑占通道寬度的一半以上。這確保了設計的通道寬度只能容納單行細胞，因此細胞進入頻率與液滴產生頻率一致。這種方法可以通過克服泊松分布的固有局限性來有效地提高封裝精度，以確保幾乎每個液滴都包含一個細胞，從而實現高封裝效率（97.9%).

Kemna等人率先使用Dean流形成單細胞排列，隨后進行單細胞包封（圖4D）。 Dean流可以誘導細胞在平衡的位置聚集，以實現所需的空間排列，確保細胞流動周期與液滴產生頻率一致，并將包封效率提高到77%。他們的方法利用微觀結構來控制細胞的規則排列，然后完成單細胞的封裝，有效地提高了單細胞液滴的比例。然而，這不僅需要控制Dean流的形成，還需要細胞和液滴頻率的同步，這很難實現。

他的團隊將螺旋和蛇形通道結合起來，有效地聚焦細胞和微珠。他們使用他們的方法包封條形碼微珠和人類小鼠細胞，然后通過測序表征細胞異質性（圖4E）。使用這種方法，與傳統的Drop-seq設備和僅用于聚焦微珠的設備相比，他們的細胞利用率分別提高了300%和40%。結果支持其微流控芯片的操作效率得到提高。這種芯片設計具有實現高效單細胞表達譜的巨大潛力。

水凝膠中的單細胞包封

除了模擬三維（3D）微環境以支持細胞的活動和功能外，將單細胞包裹在微尺度水凝膠中還可以作為進行獨立細胞操作和監測的良好工具，這對于探索類體內微環境中的單細胞活動至關重要。與單細胞包封的液滴不同，微凝膠可以形成3D網絡結構，其形態可以通過調節凝膠單體或聚合物的濃度來控制。這確保了氧氣、營養物質和生長因子的供應，以及細胞代謝廢物的及時排出，這使得在凝膠微球中培養細胞一段時間成為可能。通過應用適當的化學或物理方法，液滴中的未固化凝膠可以被激活轉化為凝膠微球?；瘜W凝膠化可以通過光誘導交聯、氧化還原誘導聚合或分子間化學交聯反應來實現。雖然通過化學凝膠化制備的水凝膠具有更高的穩定性、更長的耐用性和更好的機械性能，但使用化學交聯劑可能會導致細胞毒性，一些化學反應的低特異性可能會導致與蛋白質和細胞的意外相互作用。物理凝膠化可以經由熱介導的溶膠-凝膠轉變或離子之間的物理交聯反應來實現。在熱產生的凝膠化過程中，當溫度高于凝膠化溫度時，含有聚合物的液滴處于液態，將溫度降低到凝膠化溫度以下會導致聚合物的線性分子聚合。形成凝膠網絡結構，誘導液滴固化成凝膠微球。另一種凝膠化方法是基于靜電相互作用的物理交聯。一種常見的物理交聯凝膠化方法是通過藻酸鈉葡萄糖單元中的鈣離子和羧酸基團的螯合將藻酸鈉轉化為藻酸鈣凝膠。雖然物理凝膠化過程可以在溫和的條件下進行，但物理水凝膠網絡在組織內的機械強度通常較低，穩定性較差。因此，物理方法更適合包封細胞，并且比化學交聯方法具有更好的生物相容性。兩種類型的材料——合成聚合物和天然聚合物——用于生產包封單細胞的水凝膠微球。

使用合成聚合物進行包封在微流控液滴技術中，合成聚合物被用作生產細胞包封凝膠微球的材料，該微球可以通過化學修飾直接控制細胞微環境。常用的合成聚合物包括聚（N-異丙基丙烯酰胺）和聚乙二醇二丙烯酸酯。合成聚合物在分子量、結構和交聯密度方面具有可調節的性能，可用于生產具有不同機械性能的凝膠微球，通常比天然水凝膠更強。含有?。◣孜⒚祝┌霛B透外殼的合成水凝膠膠囊與基因組擴增等多步分子生物學檢測兼容。然而，這些合成微凝膠是不可生物降解的。

一般來說，通過紫外線聚合的合成聚合物被應用于形成凝膠微球以包封細胞。含有光引發劑、交聯劑和單體的細胞懸浮液用作分散相。微滴在微流控芯片中產生后，光引發劑在紫外光照射下，在交聯劑的作用下促進單體的交聯反應，產生凝膠微球。Kamperman等人使用聚乙二醇二丙烯酸酯作為原料，在微流體流聚焦裝置中以1 kHz的包封速度形成包封有多能性人間充質干細胞或牛軟骨細胞的微滴（圖5A）。通過下游通道中的外部紫外光源對微滴進行光交聯，以制備細胞負載微凝膠并保持高細胞活性。通過流式細胞術分選的單細胞微凝膠（純度>90%）然后與聚乙二醇二丙烯酸酯和藻酸鹽等不同的生物相容性材料混合，以創建各種模塊化生物墨水，可用于3D打印，以單細胞分辨率重建細胞微環境。然而，紫外線照射對細胞有一些毒性作用。解決這個問題有兩種潛在的方法：（1）可以減少紫外線照射的暴露時間或調整紫外線波長；（2） 可以開發新的聚合方法來避免細胞損傷。

使用天然聚合物進行封裝與合成聚合物不同，天然聚合物來源于生物體自身產生的代謝物。近年來，天然聚合物因其良好的生物相容性和溫和的聚合條件而被廣泛應用于細胞封裝。用于單細胞包封的天然聚合物包括海藻酸鈉、瓊脂糖、明膠、膠原蛋白、和透明質酸，其中海藻酸鈉，瓊脂糖和明膠是最常用的95種。

海藻酸鹽是一種從褐藻中提取的水溶性線性大分子多糖化合物，由不同比例的β-d-manuronic和α-l-古洛糖醛酸單元形成。108古洛糖核酸單元中的羧基可以與鈣、鋇和鎂等二價陽離子反應，導致快速凝膠形成。由于海藻酸鈉無毒，凝膠化模式溫和，生物相容性良好，因此通常用于制備凝膠微球來包封細胞，可應用于細胞生物學、組織工程、藥物篩選和其他生物領域。一般來說，有兩種方法可以控制海藻酸鈉的凝膠化過程：外部凝膠化，其中交聯劑擴散到液滴外部；以及內部凝膠化，其中交聯劑被加載到水相中并由刺激觸發。

Liao等人使用外部凝膠化將細胞包封在生物相容性海藻酸鈉液滴中，并將其包封在油滴中，形成基于雙流聚焦區域的雙乳液。油擴散的Ca2+進入海藻酸鈉形成微凝膠。盡管這種凝膠化方法有助于保持高細胞存活率，但由于鈣擴散的困難，微凝膠無法在短時間內完全凝膠化。為了解決不完全凝膠化的問題，研究人員提出了一種液滴融合方法來更好地制備單細胞微凝膠。Liu等人報道了一種基于微流控液滴技術制備單細胞微凝膠的新方法。他們使用含有2%海藻酸鈉或1%氯化鈣溶液的細胞懸浮液作為分散相，大豆油作為連續相，產生成對的不同液滴。兩個液滴在下游相遇并融合，Ca2+使海藻酸鈉凝膠化，形成包封細胞的凝膠微球。然而，由于交聯發生在鈣離子均勻分布之前，微凝膠的均勻性降低。此外，融合通常會導致最終交聯的藻酸鹽微凝膠的體積增加。

穆尼的團隊開發了一種內部凝膠化方法，使用流動聚焦微流體裝置制備單細胞微凝膠（圖5B）。具體來說，細胞懸浮在碳酸鈣納米顆粒溶液中，這些納米顆粒被吸附在細胞表面。在洗滌多余的納米顆粒后，將細胞懸浮液與作為分散相的海藻酸鈉溶液混合，形成油包水珠。由于油相中存在乙酸，H+擴散釋放鈣，鈣介導海藻酸鈉凝膠化形成微球。盡管這種方法可以在不進行額外下游處理的情況下顯著提高單細胞包封的效率，但只有含有細胞的液滴會被交聯，所得凝膠微球的結構也會不均勻。為了解決凝膠微球結構不均勻的問題，Utech等人提出了一種使用微流控液滴技術制備具有均勻結構的單分散海藻酸鹽微凝膠的方法（圖5C）。使用水溶性鈣絡合物作為交聯前體，可以使鈣離子在產生的海藻酸鹽液滴內均勻分布。具體來說，在將單個間充質干細胞包封在液滴中后，將乙酸加入連續相中以解離復合物并釋放鈣離子，鈣離子又與海藻酸鈉反應形成結構均勻的海藻酸鈉微凝膠。

瓊脂糖是一種從紅藻細胞壁中提取的天然線性多糖，由β-d-半乳糖和α-3,6-半乳糖苷組成。它是一種典型的天然聚合物，在37°C的溶液中由溫度引發，然后在20°C下交聯成凝膠。瓊脂糖，特別是低熔點瓊脂糖，因其良好的生物相容性和溫和的凝膠化條件而適用于細胞包封實驗。在他們的過程中，用低熔點瓊脂糖包封單個酵母細胞以形成瓊脂糖液滴，將其收集到放置在冰上的50mL離心管中以形成瓊脂糖微凝膠。將瓊脂糖微凝膠重新懸浮在合適的培養基中過夜培養，形成單酵母細胞集落微凝膠，這為集落深度測序提供了足夠的RNA，并減少了單個單細胞基因表達譜中出現的錯誤。

明膠是甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等氨基酸的混合物，通過皮膚、骨骼和肌腱等結締組織中膠原蛋白的降解形成。明膠也通過溫度誘導聚合形成網絡結構。Li等人使用明膠作為水凝膠材料來包封微藻細胞（E.gracilis和C.reinhardtii）進行單細胞培養和篩選?；诹魇郊毎g輔助分選，可以選擇具有快速生物量生產力或高脂質生產力的培養的微藻單克隆群體進行多重篩選。特別是，熱響應性明膠可以在20-27°C的范圍內維持細胞的液體培養，在4°C下發生凝膠化形成微凝膠，用于分選，當溫度升高到35°C時，發生脫膠以有效恢復細胞。雖然整個過程不會對細胞造成傷害，但復雜的凝膠化機制有一定的缺點，包括凝膠化時間長，通常需要幾個小時才能形成中等硬度的凝膠，導致實驗效率低。為了克服這一缺點，研究人員對明膠進行了化學改性。Nan等人使用甲基丙烯酸明膠，一種光學交聯明膠，可以通過紫外線照射快速凝膠化。他們的芯片上凝膠技術與微流控液滴技術無縫結合，實現了凝膠微球的高通量制備。

為了更好地模擬體內細胞的生理環境，研究人員使用多組分材料（如明膠和膠原蛋白）制備單細胞微凝膠。當單獨用作支架時，膠原蛋白的機械性能較差，但添加明膠可以通過支持細胞粘附來改善凝膠的機械性能，同時保持膠原蛋白的調節性能。微凝膠的材料特性（剛度、孔徑、交聯度和膨脹率）可以通過改變液滴的組成和交聯時間來控制。包封的細胞存活率高度依賴于交聯時間，較長的交聯時間會導致細胞存活率降低。交聯時間為8分鐘的微凝膠中約70%的細胞能夠存活一周，表明凝膠珠的形成不會損傷細胞，并可能用于未來的單細胞分析。此外，微凝膠中的單細胞大多偏離中心。為了防止細胞逃逸并實現特殊的操作目的（如長期細胞培養），Kamperman等人提出了一種微流控液滴方法，通過延遲酶交聯將單細胞定中心在由透明質酸和葡聚糖組成的微凝膠中。這種單細胞定心實現了細胞從微凝膠逃逸的持續預防（超過28天），大大提高了單細胞長期培養的可靠性。

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