摘 要 ： 快速、準確地檢測病原微生物對于疫情防控和保障人民生命健康具有重大意義。近幾年，研究者們通過合理地設計微流控芯片，將微流控技術與各種檢測技術相結合，已經開發出了多種用于病原微生物檢測的技術方法。相較于傳統的病原微生物檢測技術，微流控檢測技術優勢突出，具有操作人員技術要求不高、樣本需求量少和自動化程度高等優點，適用于各種復雜環境下病原微生物的精準、快速檢測。本文對微流控技術在病毒、細菌、真菌、衣原體及支原體等病原微生物的檢測應用進行了綜述，以期為病原微生物的檢測提供研究思路，促進微流控技術在病原微生物檢測中的發展，提高對疾病的預防和控制能力。

病原微生物是指能夠引起人類或動物疾病的微生物，包括病毒、細菌、真菌、衣原體和支原體等。病原微生物可以通過空氣、體液等介質傳播，危害人體健康，造成財產損失。因此，對病原微生物快速、準確以及靈敏的檢測是降低其危害的重要手段。傳統的病原微生物檢測方法包括染色、培養、生化鑒定等方法，存在耗時長、成本高、操作復雜等缺點。微流控技術的出現為病原微生物的低成本、高通量、高效率檢測提供了新的研究思路和方法。本文基于微流控技術在不同病原微生物檢測中的研究進展作一綜述，旨在為微流控技術在病原微生物檢測中的研究提供參考，進而推動微流控技術在病原微生物檢測中的應用。

1 微流控概述及其分類

1.1 微流控的簡介

微流控（microfluidics）指的是使用微管道（尺寸為數十到數百微米）處理或操縱微小流體（體積為納升到阿升）的系統所涉及的科學和技術。微流控系統通常包含閥門、微通道、反應室、壓力系統和檢測系統，通過控制微流控裝置內流體的運動來實現樣品制備、反應、分離和檢測等功能。微流控技術能夠控制微小流體，整合多種反應，其在病原微生物檢測中可以在微觀水平上精確控制樣品體積并減少體內和體外環境之間的差異，進而達到縮短反應時間和降低檢測成本的目的，具有快速、準確、樣品消耗少等優點，為病原微生物的檢測提供了廣闊的前景。微流控技術在病原微生物檢測中的應用如圖 1。

圖 1 微流控在病原微生物檢測中應用

1.2 微流控技術的分類

微流控技術發展迅速，種類眾多，應用十分廣泛，對于微流控技術種類的劃分還沒有統一的標準。基于微流控芯片的驅動方式可將其分為主動型微流控和自驅型微流控。主動型微流控一般利用的是外源性驅動力進行微流體的操控，主要包括壓力型微流控、離心型微流控、磁力型微流控、數字化微流控等。各類型微流控特點如下 ：（1）壓力型微流控 ：利用氣體壓力或液壓或氣液壓混合，來控制液體在芯片中的運動；（2）離心型微流控：一般為對稱盤式構型，利用旋轉產生的離心力來驅動液體在芯片中的運動；（3）磁力型微流控 ：利用磁場來控制流體中的磁性物質，以驅動流體的運動 ；（4）數字化微流控 ：基于微升至納升范圍內的液滴精準操作，來實現復雜的實驗室分析的獨立平臺，其微滴由液體表面張力特性形成。上述是常見的幾種微流體驅動方式，研究人員通常將多種驅動方式組合來實現特定的目標功能。

自驅型微流控通常利用表面親疏水特性或毛細力來進行流體的輸運與處理，具有自驅動、無需外接動能、操作方便和容易控制等特點。其原理是基于紙質材料的易塑形、多孔、親水、毛細管作用等特性進行物理或化學加工后構建出的平面（2D）或立體（3D）的紙基微流道，該微流道集樣品前處理、分離、分析等功能于一體，可實現微量樣本的快速檢測。目前文獻所報道的微流控裝置多是外源驅動型微流控，而高通量、低能耗或無需外源驅動的微流控檢測技術是未來主要發展趨勢。

2 微流控技術在病原微生物檢測中的應用

2.1 微流控技術檢測病毒

基于微流控技術的病毒檢測方法主要針對病毒細胞數量、表面特異性蛋白和特異性核酸片段來開展檢測。基于病毒細胞培養的空斑測定法是病毒鑒定和診斷的金標準，但存在通量低、所需樣品量大等問題，因此 Su 等設計了可以同時培養 5種病毒的聚二甲硅氧烷芯片，該芯片系統不僅實現了病毒的高效鑒定，還完成了病毒的分離和抗病毒藥物的篩選，具有通量高和檢測樣本量少的優點。

微流控芯片培養法解決了傳統培養法存在的一些問題，但仍存在培養周期長等限制，所以需要開發耗時少、精確度高的檢測方法。而靶向病毒表面特異蛋白的微流控技術可以很好地解決目前培養法存在的問題，因而，Saraf 等基于適體和適體功能化的金納米粒子與目標蛋白形成三明治夾心結構，然后和銀試劑反應獲得比色信號，設計了對寨卡病毒和基孔肯雅病毒等病毒包膜蛋白進行多重檢測的微流控檢測芯片，該芯片系統在 2 h 內完成了對磷化氫緩沖鹽水和小牛血中寨卡病毒和基孔肯雅病毒的高特異性檢測。為了在微流控檢測系統中實現對多靶標蛋白的靈敏識別，Guan 等設計了一個集成兩種單克隆抗體（mAb）的微流體系統，用于腸道病毒 71（EV71）的靈敏檢測。該系統將 EV71 的主要衣殼蛋白 VP1 的單克隆抗體 1F4 和 2H2 分別與羧基官能化磁珠和羧基官能化量子點偶聯，最后通過熒光強度來直接評估靶標蛋白的濃度。該微流體系統在 30 min 內對 VP1 的檢測限（LOD）達到 10pg/mL，與使用相同抗體的夾心酶聯免疫吸附試驗的結果（310 pg/mL）相比，提升了 31 倍。

隨著技術的不斷完善與發展，基于病毒表面特異蛋白的微流控技術在耗時、特異性以及靈敏度等方面均有很大的提升，但是面對低豐度、高感染性的病毒靶標時，仍存在靈敏度不夠的問題，而以精確度高著稱的核酸檢測法可以彌補蛋白檢測法存在的缺陷。基于此，Tian 等開發了一種檢測病毒特異性核酸序列的全自動離心微流控系統（圖2?a），所有檢測流程被整合到封閉的自動化微流體系統之中，當口咽拭子樣品被注入微流控盤后，該系統自動進行樣品處理、反轉錄環介導等溫擴增、熒光信號檢測等檢測流程，其在 70 min 內完成了對 21 個樣本的高靈敏檢測，最低檢測限達到 0.5copies/μL。而當面對致病率極高的病毒時，快速且高效地篩查出陽性患者是有效開展防疫工作的保障，因此，Li 等基于一個獨立的微流控系統開發了一種簡單、靈敏和無需儀器的病毒檢測系統（圖 2?b）。

圖 2 病毒檢測微流控系統

該系統將等溫擴增、CRISPR 技術和側向流動檢測集成在一個封閉的微流體芯片中，當 RNA 病毒樣本加入到微流控芯片后，通過側向流動試紙，肉眼即可直接觀測檢測結果。這種操作簡單、靈敏度高、成本低的微流控系統有望被推廣應用到大規模的病毒篩查檢測中。

目前常見的微流控系統通常需要外源驅動，所以動力供應會限制微流控技術的應用和發展。基于此，Yao 等設計了一種自供電快速加載微流控芯片（圖 2?c），可同時檢測裂谷熱病毒、基孔肯亞病毒和登革熱病毒 I、II、III 和 IV 亞型等 8 種病毒，無需外源驅動，50 min 內即可完成檢測，靈敏度可達 50-100 copies/μL。Kim 等研究發現具有毛細作用力的紙基微流控在無外源驅動條件下即可實現對病毒的捕獲和檢測，利用其獨有的特性開發了一種手持式紙基微流控系統，可直接捕獲空氣中的液滴進行檢測。通過在空氣中噴灑含有病毒的人類唾液樣本來模擬自然環境，驗證發現該系統從捕獲病毒到智能手機完成數據分析總耗時 30 min。這項技術為提高微流控系統的病毒檢測效率提供了新思路。

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