開發具有與原生絲相似特性的人造蜘蛛絲一直是材料科學中一項具有挑戰性的任務。在這項研究中，我們使用微流控裝置來創建基于重組 MaSp2 螺蛋白的連續纖維。該策略結合了離子誘導的液-液相分離、pH 驅動的纖維顫動和剪切依賴性誘導β片形成。我們發現纖維形成需要大約 72 Pa 的閾值剪切應力，并且β片的形成取決于重復序列中聚丙氨酸塊的存在。所形成的MaSp2纖維的β片含量（29.2%）與剪切應力要求為111 Pa的天然吊斗鏟相當，有趣的是，聚丙氨酸塊對液-液相分離和分層結構的影響有限。研究結果為蜘蛛絲剪切誘導結晶及層織關系提供了新的發展思路，對人工紡絲纖維的合理設計具有重要意義。

蜘蛛拉鏟絲是一種基于蛋白質的生物聚合物，體現了無與倫比的強度和柔韌性組合，引起了廣泛的科學興趣。在實驗室中，已經做出了各種努力，從螺蛋白前體成分中生產合成的吊索絲;然而，復制天然纖維的機械性能仍然是一個艱巨的挑戰。這也許不足為奇，因為拉索絲的性能源于其復雜的分層子結構，為了實現這一目標，蜘蛛采用了一種復雜的機制，該機制通過模塊化螺旋體結構域中的構象變化來協調，響應精確定時的化學觸發，結合在絲腺旋轉管道的有限幾何形狀內產生的物理力.

人造絲紡絲的經典方法通常涉及通過惡劣的變性條件（例如濕紡中的酒精凝固浴）將非天然蛋白質原料轉化為纖維材料。然而，最近，人們越來越有興趣應用仿生技術在生態良性的條件下生產具有類似天然結構和功能的纖維。在這里，重點是復制微妙的生化過程，這些過程協同作用使蠶絲纖維在自然系統中自組裝。這些事件包括液-液相分離 （LLPS），這被認為是多種蛋白質纖維預組裝的關鍵步驟，并且在螺旋體中，它通過重復結構域 （RPD） 和 C 末端結構域 （CTD） 進行調節，以響應 kosmotropic 離子的梯度，例如磷酸鹽。同時，酸化梯度通過 N 末端結構域 （NTD） 介導螺旋蛋白鏈的快速端到端多聚化，以及 CTD的去折疊。剪切和伸長流等流變效應也是主要考慮因素，因為它們促進了紡絲管道內螺旋蛋白鏈的逐漸排列，并啟動了廣泛的 RPD 從基本無序狀態向有序分子間相互作用的轉換，從而能夠形成分散的β片納米晶體，從而賦予纖維更高的強度.

微流控技術在結構蛋白的組裝中呈現出令人興奮的前沿，其中復雜的宏觀結構可以構建，至少在理論上，通過定制的通道排列和所需的時間順序以靈活的方式引入相關的生理觸發器。事實上，對于人造絲紡紗，基于微流控的方法被認為比更傳統的技術具有促進類似天然纖維組裝的最大潛力。特別是，旋轉管道的受限尺寸和幾何形狀決定了關鍵的流動參數，可以在芯片中小型化通道的設計中得到近似。

先前的研究報道了在紡紗人造蜘蛛絲中結合微流體原理。在仿生保真度方面，這些方法包括各種重組螺旋蛋白序列、微流控芯片設計、化學觸發成分以及所應用的關鍵處理步驟的外化。一個值得注意的例子顯示，通過在微流控裝置中連續引入磷酸根離子和 pH 值降低，使用三域 ADF3 螺旋體形成纖維。然而，至關重要的是，以前的研究沒有報道過具有多級納米級亞結構的纖維的生產，這是天然絲綢自組裝的標志。補充表1總結了重組螺旋體微流控紡絲的差異比較。有趣的是，對于再生絲素蛋白（RSF）的紡絲，微流控芯片內部產生的力已被量化，以顯示沿通道的剪切和伸長率的分布，揭示了這些力與β片內容物之間的關系。然而，在重組螺旋體的情況下，尚未對微流體通道內的力進行這種定量分析，以將力與纖維的形成和構象的變化聯系起來。與RSF相比，天然狀態下的重組螺旋體對導致自組裝行為的自然發生的觸發因素反應更靈敏。因此，量化類天然條件下的剪切應力等力對于更好地理解蜘蛛絲自組裝機理具有重要意義和意義。

在這里，我們提出了一個合理設計的微流控系統，旨在通過整合有關體內自組裝過程的最新見解來模擬天然絲紡設備的功能。通過連續施用觸發相分離和納米纖維形成的仿生化學梯度，以及通過可量化的剪切效應，我們證明了來自重組 MaSp2 前體的多級結構絲纖維的完整原位組裝，具有可調的β片豐度和近乎瞬時的速度。

仿生微流控裝置的電子標志

我們旨在設計一種仿生微流控裝置，該裝置近似通道內的天然化學和物理梯度，用于研究蜘蛛絲纖維組裝。該芯片的架構如圖1a所示。它包括 3 個入口，即（1）前體螺旋體溶液、（2）中性 pH 下的 kosmotropic 離子和（3）低pH值顫化觸發器。該架構提供了兩個順序混合區域，然后是終止于出口的擴展通道，并沿設備定義了三個區域，用于監控自組裝的連續階段（A、B 和 C 部分）。該設計合理化如下：在流動開始時，源自 （1） 和 （2） 的流合并，使螺旋體暴露于類似于蜘蛛紡導管中發現的 kosmotropic 陰離子梯度，預計會觸發 MaSp2 的 LLPS，新生的蛋白質液滴通過層流通過 A 部分向下游輸送。 隨后沿相反方向與源自 （3） 的流接觸會產生 pH 梯度， 它模擬了自然酸化效應，并有望觸發螺旋體冷凝物凝固成纖維狀網絡（B 部分）。C部分構成一個尺寸為2 cm×80 μm×62 μm的直通道，預計機械變形會促進延伸絲狀纖維的組裝。

需要說明的是，我們選擇了一種簡化的設計，其中每個單獨的通道都具有均勻的橫截面，并且寬度從B（60μm）增加到C（80μm），以便關注剪切在調節纖維組裝和結晶方面的影響，同時最大限度地減少拉伸流的影響。這與天然紡絲管道中發現的更復雜（即收斂）幾何形狀形成鮮明對比，在自然紡紗管道中，管道朝向噴絲頭逐漸變窄會產生強大的拉伸流，有助于絲分子的排列。值得注意的是，我們系統中的樣品流是通過從出口施加負壓（真空）來啟動的，這在以前的絲狀纖維組裝策略中并不常見，其中流動通常通過正壓23或注射器泵送28,29技術產生;這是為了模仿天然絲纖維從生物體中“拉出”而不是被“推出”的觀察結果（拉擠）14,30;此外，這還能夠對微流體裝置內產生的力進行微調控制。

從LLPS到納米纖顫再到纖維形成的類天然絲組裝

作為蜘蛛絲構建單元，我們使用了重組 MaSp2 吊索螺旋體，具有一系列結構域結構（圖 1b），包括 N-R6-C 和 N-R12-C 的完整構建體（分別具有 6 個和 12 個串聯重復序列）、截短構建體 N-R6-x、x-R6-C 和 x-R6-x，以及用交替甘氨酸和絲氨酸殘基 （GSGSGSG） 替換聚丙氨酸塊的三結構域 N-R12-C（xA） 變體， 評估纖維組裝過程中β片形成的順序依賴性。制備的螺旋體通過SDS-PAGE確認。

在微流體系統之外，通過暴露于中性pH值下的科斯級離子，可以很容易地誘導三域MaSp2形成LLPS液滴（圖1c），而在酸性條件（pH 5.5-5.0）下，LLPS和NTD介導的多聚化的聯合效應產生了自發和快速的網絡組裝（圖1c）。在這項研究中，我們使用混合檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液 （CPB） 系統作為一般的 kosmotropic 觸發因素，因為與單個磷酸鹽和檸檬酸鹽成分相比，它在相關 pH 值范圍 （7.5–5.0） 內的緩沖能力有所提高。

逐步仿生過程被集成到微流控系統中，并優化為以最小的干預生成分層結構的 MaSp2 纖維。該方法本身只需在恒定負壓下在入口 3、2 和 1 處依次添加組件，然后立即停止泵。根據經驗建立了有效纖維形成的條件，我們將其定義為在微流體通道內產生單個連續纖維，不包括纖維斷裂或聚集體或其混合物的形成。在這里，發現纖顫緩沖液的組成至關重要，在濃度在1-1.5 M和pH值為5.0之間時，CPB以及施加壓力的大小以及所施加壓力的大小都獲得了最佳結果。

圖2a概述了在?90 kPa壓力下，在50 mg/ml（入口1）、50 mM CPB pH 7.0（入口2）和1.0 M CPB pH 5.0（入口3）下使用標記構建體N-R12-C獲得的結果。在整個通道長度上可以觀察到凝聚的 MaSp2 結構，通過器件的連續階段，中尺度形態發生了明顯的演變。沿著A段，入口1一側的通道壁上密布著大致呈球形或無定形的MaSp2冷凝物沉積物，具有部分液滴融合和表面潤濕特性，與LLPS的形成和蛋白質液滴通過層流向下游遷移一致（圖2a-c）。該結果與液滴的動態形成和融合行為一致，如圖1c所示。盡管緩沖相和層流觸發器之間的表面接觸相對有限，但MaSp2能夠進行廣泛的LLPS，這一事實表明初始條件接近相分離邊界，這確保了當兩股流接觸時迅速相分離。

在B段中，MaSp2凝聚水轉變為具有顆粒表面的扁平片狀形態，這是由酸化梯度的綜合效應引發的突然變化，酸化梯度觸發了纖維化，以及通道幾何形狀變化引起的剪切效應。除了B部分形態的明顯變化外，螺旋體的相應結構還受到該纖維化階段引入的化學和物理觸發因素的影響（見下文）。再往下游，在C部分，我們看到在整個通道長度上形成了連續的不間斷纖維，圓直徑為5-10μm。在這里，纖維的分層子結構非常明顯，由沿縱軸取向的密集堆積的納米原纖維組成（圖2d，e;補充電影 2），驗證了仿生自組裝策略。實際上，在設備C部分中形成的對齊納米纖維束可以被認為是類似于在pH 5下將MaSp2與CPB混合時在設備外部組裝隨機蛋白質網絡結構（圖1c），由通道內的定向流動提供原纖維排列的額外因素;換句話說，在蛋白質網絡單軸取向后，2D網絡結構可以轉化為1D納米纖維。形成后，可以從設備中回收纖維以進行進一步分析。值得注意的是，纖維能夠在純水中保持結構完整性并表現出高柔韌性（圖2f）。在一些局部區域，整體纖維結構確實破裂了，這清楚地揭示了一個由具有高縱橫比的單個蛋白質原纖維組成的底層亞結構，并沿纖維的縱軸取向圖2g。在補充電影 3 中展示了構建體 N-R12-C 纖維組裝后微流控裝置的整個長度的可視化，這提供了分層組織的進一步證據。

有趣的是，雖然完整的結構（即 N-R6-C 和 N-R12-C）產生了具有微觀下無法區分形態的纖維，但截短的變體 N-R6-x、x-R6-C 和 x-R6-x 在相同條件下未能產生任何纖維，這強調了不同結構域之間在天然條件下成功自組裝蜘蛛絲的關鍵相互作用12。此外，雖然缺乏聚丙氨酸塊的三結構域N-R12-C（xA）在A和B段中表現出與N-R6-C和N-R12-C結構相似的形態，但C段產生的纖維結構經常在通道內破裂，反映了這些結構的明顯力學弱點。

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