微陣列芯片 SELEX 技術篩選適配體

微陣列芯片及其分類

微陣列芯片是通過微點陣技術或微顆粒填充技術將數以萬計的生物探針固定在基板上,通過生物探針與溶液中的待測分子特異性結合完成分析和檢測過程。 微陣列芯片表面不存在微通道、微腔室等微結構,無需考慮流體在芯片內部流動造成的堵塞和氣泡等問題,降低了芯片加工和使用的難度。 另外,微陣列芯片的實驗結果可通過計算機陣列分析技術獲得。

核酸微陣列芯片與蛋白質微陣列芯片

核酸微陣列芯片常以玻璃、硅和塑料作為基板材料,通過光引導原位合成技術或物理遞送技術制造高密度核酸陣列,其中,物理遞送技術,如噴墨或微噴射沉積,可將納升甚至皮升的溶液體積分配和點樣到微陣列芯片的特定部位。 微陣列芯片上檢測探針與帶有修飾的報告探針(如熒光、化學發光、放射性同位素等) 結合,通過檢測報告探針完成信號檢測。

與核酸微陣列芯片相同,蛋白質微陣列芯片的構建最初是直接將蛋白質點樣在相關載體上。 常用于制作蛋白質微陣列芯片的載體有硝酸纖維素膜、硅樹脂、玻璃和塑料等。 載體的固定對蛋白質的生物活性和空間結構的維持有一定的影響。 另外,常見的蛋白質微陣列芯片的制備工藝中通常只點樣一種蛋白質,將多種蛋白質點樣在一塊微陣列芯片上的報道較少。

微顆粒陣列芯片

微顆粒因其具有比表面積大、結合動力學快的特點而在生化分析中得到廣泛應用。 與傳統的平面微陣列芯片相比,微顆粒微陣列芯片利用其上的微顆粒可實現對生物分子的更快、更靈敏的檢測。 同時,微顆粒微陣列芯片易實現多種蛋白質的固定。

摻雜 DMAP 和丙烯酰胺/ 雙丙烯酰胺的溶液按照掩膜圖案進行交聯反應,形成微陣列芯片的微結構,并采用物理俘獲法實現微顆粒在微陣列芯片上的填充,有效克服了靜電自組裝和電場輔助組裝中微顆粒必須帶電的問題。 每塊芯片上有 40 個凝膠墊陣列單元,每個單元外周均以聚乙二醇微柱作為親水屏障,將試劑和樣品限制在微陣列芯片上。他們利用該芯片初步實現了前列腺特異性抗原和人絨毛膜促性腺激素的免疫測定。 Kim 等報道了一種微顆粒陣列芯片的加工工藝,即用停流光刻法進行微顆粒的加工,通過負壓法實現微顆粒在陣列芯片上的填充。 另外,他們還通過改變掩膜圖案,制作出形狀各異的微顆粒,并成功生成了防偽應用程序的二維粒子陣列代碼。

微陣列芯片不存在氣泡等問題帶來的干擾,而且微陣列芯片上固定的靶標數量大、種類多。 特別是微顆粒陣列芯片的出現,可使不同靶標分子固定于不同微顆粒上,再將這些微顆粒填充于相應區域,便于檢測且不會產生干擾。 微陣列芯片與 SELEX 技術的結合為發展新型適配體篩選技術提供了思路。

微陣列芯片 SELEX 在適配體篩選中的應用

基于溶膠-凝膠的微陣列 SELEX 技術篩選適配體

基于微陣列 SELEX 技術篩選適配體時,研究者將蛋白質靶標包裹于凝膠顆粒內,再點樣于微陣列芯片上,可有效維持蛋白質的生物活性和空間結構。 例如,Park 等將包裹有蛋白質的凝膠顆粒點樣在微加熱器上,在微混合器的作用下,先后在微陣列芯片上完成寡核苷酸文庫與靶標分子的結合、洗滌和洗脫等過程。 目前,利用該芯片可同時實現 5 種靶標分子適配體的篩選。

溶膠-凝膠顆粒已廣泛用于大分子的捕獲,但將其應用于小分子的捕獲時仍存在一定挑戰,原因在于,若將溶膠-凝膠設計為截留小分子,通常會損害溶膠-凝膠顆粒與常規基質(如微量滴定孔板聚合物)的粘附性。Ahn 等基于陽極刻蝕技術和電化學工藝開發了一種多孔聚苯乙烯(PS)基質,該材料可有效錨定多種不同孔徑的溶膠-凝膠顆粒(圖 4)。 研究者將包裹雙酚 A 的溶膠-凝膠顆粒固定在 PS基質上,考察了基于溶膠-凝膠顆粒的微陣列芯片 SELEX 技術篩選雙酚 A 適配體的可行性,為小分子適配體的篩選開辟了一條通用途徑。

圖 4 基于聚苯乙烯-溶膠凝膠芯片的適配體篩選技術示意圖

微陣列耦合微流控的 SELEX 技術篩選適配體

微流控芯片技術能較好地集成靶標分子與寡核苷酸文庫的結合、洗滌和洗脫等篩選步驟,而微陣列芯片的超高通量的特點也有助于實現多個靶標分子適配體的同時篩選。 因此,微陣列耦合微流控的 SELEX 技術在適配體篩選中具有更大的優勢,可發揮更大的作用。

Liu 等發展了一種微陣列耦合微流控芯片的 SELEX 技術( Protein microarray integrated with amicrofluidic chip, PMM-SELEX),用于篩選蛋白質的適配體(圖 5)。 利用物理俘獲法將靶標分子吸附在微陣列芯片的蛇形微通道上,在靶標分子與寡核苷酸文庫結合后,通過微陣列芯片掃描技術檢測靶標分子與寡核苷酸文庫的結合情況。 研究結果表明,PMM-SELEX 技術省時、高效,僅需 5 輪篩選即可得到對乳鐵蛋白具有較高親和力(Kd = 0. 63 nmol / L)的適配體。

Gortrik 等通過將寡核苷酸文庫固定在微陣列芯片上,篩選出多條適配體候選物,并通過微流控技術和高通量測序技術分別實現了適配體的分離與測序,克服了篩選過程輪次多、鑒定耗時等缺點。

圖 5 蛋白質微陣列耦合微流控芯片的適配體篩選原理示意圖

適配體對(Aptamer pairs)可同時識別靶標分子不同表位,有助于增強檢測的靈敏度和特異性。然而,適配體對很難通過篩選得到,因為在常規篩選過程中會優先產生可識別顯性“熱點冶表位的適配體,而熱點表位適配體的確定,對另一表位的結合存在一定的阻礙作用。Cho 等建立的基于微陣列芯 片 的 適 配 體 對 篩 選 平 臺有效克服了這一問題,實現了適配體對的篩選(圖 6)。

圖 6 基于陣列的多價適配體篩選平臺示意圖

基于微流控及微陣列芯片 SELEX 技術的適配體篩選進程監測技術

適配體的篩選過程必須配合實時監測技術,從而有效地獲得具有更高親和力、更強穩定性的適配體。

表面等離子體共振(Surface plasmon resonance, SPR)通過適配體候選物與靶標分子結合引起的金屬膜表面共振角的改變對 SELEX 篩選進程進行監測。 雖然,利用 SPR 容易對適配體候選物與靶標分子的結合情況進行評估,但早期研究發現,大多情況下,第 1 輪篩選并未檢測到 SPR 信號的變化,顯然傳統的 SPR 并不適于高通量檢測。 將金納米顆粒引入 SPR 的局域表面等離子體共振可有效增強 SPR 信號的輸出。

Gifford 等使用金納米顆粒增強的 SPR 成像技術實現了 PCR 產物的高靈敏檢測。 與金納米顆粒相比,銀納米顆粒可產生更強的共振信號,據此構建的“金核銀殼冶結構可更好地監測篩選過程。 Jia 等將微流控芯片和 SPRI 技術整合至 SELEX 過程中,利用十面體銀納米顆粒(Ag10 )增強表面等離子體共振信號強度,完成了對乳鐵蛋白的適配體的篩選,將檢測信號提高了 128 倍。 在后續的研究中,Jia 等利用十面體銀納米顆粒探針(Ag10-NPs-RP15 )在實時監測 SELEX 過程的同時,消除了因靶標分子末端固定導致的其與適配體候選物親和力降低的影響,篩選得到了脂質運載蛋白-1(Lipocalin-1)的適配體。

表 1 傳統 SELEX 技術與基于微流控芯片和微陣列芯片 SELEX 技術的對比

小分子與適配體分子量差異較大,兩者親和力的表征也是難點之一,目前尚無通用的表征方法。Ahn 等將包埋有 BPA 的溶膠-凝膠顆粒固定在微陣列芯片上,利用熒光素標記 BPA 適配體候選物,與小分子結合的適配體候選物無法從溶膠-凝膠顆粒中逃逸,從而可觀察到顆粒的熒光。 但是,這種熒光標記探針的方式對適配體的折疊有潛在影響,可能會進一步影響適配體與靶標分子的結合。 表征小分子與適配體親和力的另一種方法是反向散射干涉術(Back scattering interferometry, BSI),即利用激光照射樣品,光束在通道內被反射和折射,形成特定的條紋圖案,并由電耦合器件( Charge coupled device, CCD)實現陣列檢測。 監測過程中,適配體和靶標分子均游離在溶液中,無需固定和標記。Kammer 等成功地將該技術用于抗生素(如替諾福韋、表阿霉素、氨芐青霉素和四環素)以及激素、神經遞質等小分子與適配體的親和力表征研究中。

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