1.單細胞測序概論

過去二十幾年里，隨著基因測序技術水平的提高以及千人基因組計劃、癌癥基因組計劃、Meta-Hit計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研究日漸被推向高潮。以“高通量”為特點的第二代測序( next generation sequencing,NGS) 技術和以“單分子測序”為標志的第三代測序( third generation sequencing,TGS)技術,引起組學研究領域的巨大變革。高通量測序儀能夠對幾十萬到幾百萬條DNA分子同時測序,精確讀出數以千億計( 每1次run) 的堿基,實現了快速、高效、低成本的基因組尺度測序。一般地,高通量測序需要從大量細胞中獲取足夠的DNA樣品,因此測序結果是這些細胞“整體”的一個表征。然而,由于細胞異質性,相同表型的細胞的遺傳信息可能存在顯著性差異,很多低豐度的信息會在整體表征中丟失。例如,實體瘤樣本中提取的總DNA,50% 以上來源于非癌性成纖維細胞、內皮細胞、淋巴細胞或巨噬細胞,使得癌細胞的信號可能被隱藏。另外,自然界中存在大量的難以培養富集的微生物,例如在人體中,90% 以上的微生物都是不能進行體外培養的。由于細胞數目有限,這些微生物的序列信息則很難通過傳統高通量測序獲得。作為“在單個細胞水平上對基因組進行測序”的單細胞測序技術能夠解決上述難題。與傳統的全基因組測序相比，單細胞測序不僅測量基因表達水平更加精確，而且還能檢測到微量的基因表達子或罕見非編碼RNA，其優勢是全方位和多層次的。2011年，《自然方法》雜志( Nature Methods )將單細胞測序列為年度值得期待的技術之一，2013年，《科學》雜志（Science）將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首。目前,單細胞測序技術已經初步應用到了海洋微生物多樣性以及癌癥患者體細胞突變多樣性的研究中。我國在單細胞測序領域處于國際領先水平,深圳華大基因率先建立了單細胞外顯子組測序技術,應用于骨髓增殖性腫瘤和腎透明細胞癌的研究中,在單個細胞的水平上解析了瘤內細胞遺傳異質性,為癌癥的發生發展機制及診斷治療開辟了新方向,并為其他類型腫瘤的研究提供了新思路。

2.單細胞測序技術的原理

單細胞測序主要包括單細胞基因組測序、轉錄組測序和表觀遺傳測序,這3種測序類型各具特點和優勢,可以從不同角度揭示細胞各個階段的功能和特性。全基因組測序是對目的細胞的全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增,隨后利用外顯子捕獲技術進而使用高通量測序的過程。轉錄組測序則是獲取特定器官或組織在某一狀態下的幾乎所有轉錄本,尤其適用于具有高度異質性的干細胞及胚胎發育早期的細胞群體的研究。以NGS為基礎的各種表觀遺傳學測序可揭示基因調控的不同方面,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質結合結構和調節蛋白、染色體的空間結構與空間相互作用形成轉錄復合物的組分。表觀遺傳改變是可逆的,并決定基因表達和負責細胞的異質性。

3.單細胞測序技術的流程

細胞測序主要涉及4大步驟,包括單細胞分離、核苷酸序列(DNA或RNA)擴增、基因測序和數據分析。

單細胞分離

要對單個細胞進行研究,首先要將目的細胞從生長環境中分離出來,并確保其生物完整性。目前常用的單細胞分離方法有連續稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割術( laser capture microdissection,LCM)、拉曼鑷子技術( Raman tweezers)、熒光激活細胞分選術( fluorescence activated cell sorting,FACS)和微流控技術( microfluidics)等。連續稀釋法操作簡單、成本低廉,主要通過連續稀釋樣品來獲取單個細胞。其缺點在于,容易出現分離錯誤或細胞丟失,不能進行靶向分離。因此,該技術很少用于復雜微生物樣品的單細胞分離。顯微操作法是借助機械顯微操縱儀或可視化鑷子分離單個細胞。這種方法不僅操作簡單、成本低廉,而且能夠進行可視化操作,目前已經應用到許多難以培養微生物的單細胞分離中,例如從白蟻腸道中分離共生體,從水稻土壤中分離蒼白桿菌( Ochrobactrum)等。顯微操作法雖然實現了可視化分離,但是人力投入大和通量較低等不足限制了該技術的廣泛應用;另外,該技術還會對細胞造成機械性損傷。激光捕獲顯微切割術( LCM)能夠直接從組織塊中分離單個細胞,廣泛應用于臨床研究中。該技術首先將組織進行切片、裝片和染色處理,進而通過可視化操作分離單細胞。其優勢在于,能夠保持細胞的形態學結構,保留細胞在組織中的空間位置信息。但是其劣勢在于,細胞核容易被刨切而導致染色體片段丟失;另外,該技術由于精確度有限,切割過程中會不可避免的摻入相鄰細胞的原生質組分,因此不適用于轉錄組學分析。拉曼鑷子技術結合了拉曼顯微光譜學和光學捕獲技術,前者能夠通過輪廓區分細胞而無需染色,后者利用激光捕獲細胞。但這種方法僅限于分析形態學差異較大的細胞群。

目前單個腫瘤細胞分離通常是通過磁珠激活細胞分選(magnetic-activated cell sorting,MACS)或熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)技術進行。這兩種分離方法的成本較高,但是能滿足高通量、自動化的要求。免疫磁珠分離法(immunomagnetic separation,IMS)屬于MACS技術,即利用細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合。在外加磁場中,與磁珠相連的帶有表面抗原的細胞被吸附而滯留在磁場中,不能與磁珠連接的細胞不在磁場中停留,從而使目的細胞得以快速分離,但操作方法相對復雜。

熒光激活細胞分選技術是目前應用最多的單細胞分離方法,可對單個細胞進行高效和快速分離。FACS平臺通過依靠熒光標記信號結合光散射分析參數,對具有異質性的腫瘤組織的單個細胞進行挑選和分析。該法不僅具備高通量的優勢,而且可對具有不同表征(如大小、粒度、特異性抗原標記、同位素標記等)的靶細胞進行識別和分離。其最大的缺陷是分選時需要大量的細胞,因此在制備大量細胞懸液的過程中可能降低低豐度細胞的獲取率;同時FACS所檢測的熒光信號相對較低,部分低表達的標記可能檢測困難,存在特定細胞類型丟失的風險;此外,細胞的高速流動可能造成機械性損傷。

另一個新發展的微流控技術(microfluidics)則是通過人為控制流體流動來實現在微尺度上對目的細胞進行分離,主要利用流控通道具備的多種功能對細胞進行分選,如通道本身具有可調節的直徑(10~100μm)和多種功能性修飾(如捕獲分子、抗體、電極等)。同時微流控裝置的細胞污染率低,對樣本和試劑損耗少,并且在降低單細胞測序的噪聲以及提高基因組擴增一致性方面具有優勢,已有相應的商業化平臺在推廣應用。

細胞溶解與基因組DNA獲取

分離得到單細胞后,需要將細胞進行溶解來獲取基因組DNA( genome DNA,g DNA)。這一步驟非常關鍵,g DNA的質量直接影響后續基因組擴增的效果。目前細胞溶解的方法可以分為3大類:物理法( 如超聲、冷凍、研磨、剪切、高壓和熱破壞法)、化學法( 如SDS、triton X-100和極端pH)和酶降解法( 如蛋白酶K和溶菌酶)。細胞溶解方法的選定,需要綜合考慮多方面因素,如細胞的類型、下游用途、g DNA純化難易程度等。

在傳統高通量測序流程中,細胞溶解獲得的g DNA需要通過進一步純化后才能用于擴增。但是對于單細胞測序,為了避免g DNA在純化過程中丟失,目前大部分流程已經省去了這一步驟。在某些基因組中,各位點僅存在1個拷貝,純化過程中的樣品丟失會直接導致擴增產物中的位點缺失,嚴重影響后續的基因組重建。g DNA純化步驟的省略,對細胞溶解操作提出了更加苛刻的要求,那些可能與基因組擴增試劑相互作用的溶解試劑都應當避免使用。另外,DNA結合蛋白通常會阻礙模板擴增,需要事先將其切割或變性;蛋白酶(如蛋白酶K和胰蛋白酶)可以高效地溶解DNA結合蛋白,目前廣泛用于待擴增模板的預處理中。

全基因組擴增(WGA)

高通量測序至少需要200 ng的DNA樣品,而1個細胞中的總DNA一般僅有數匹克,即使使用第3代測序技術可能也無法滿足樣品量的需求,因此WGA對于單細胞測序是非常必要的。全基因組擴增技術主要分為兩種類型：一是基于熱循環以PCR為基礎的擴增技術，如簡并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、連接反應介導的PCR (LM-PCR)、擴增前引物延伸反應(PEP)等；一是基于等溫反應不以PCR為基礎的擴增技術，如多重置換擴增(MDA)和基于引物酶的全基因組擴增(pWGA)。

在這兩種類型中，PCR擴增比較經典，但是，對不同的序列來說，PCR擴增的效率存在相當大的偏差，易產生擴增偏倚問題：如富含CG的DNA序列和相應基因座位的非隨機丟失，等位基因的非隨機丟失，以及與DNA片段大小相關的偏差（傾向于擴增更多短片段），尤其是在應用于單細胞時，大量短片段導致片段間序列丟失，從而使其應用受限。

MDA是目前公認的最好的單細胞基因組擴增技術，它能對全基因組進行高保真的均勻擴增，擴增出10~100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。但是MDA也有一些缺點，特別是顯著的非特異擴增。另外就是全基因組覆蓋度不均勻;等位基因丟失率高(可高達65%);污染或干擾;隨機引物與模板結合能力差異導致的擴增偏倚。針對MDA潛在的污染問題(包括外源性或交叉污染),目前主要采取的改進措施是將熒光標記(例如SYBR Green)摻入反應體系中,以便對擴增過程進行可視化的熒光監測。該技術已成功應用于腫瘤單細胞測序;另一項極具創新性的技術MALBAC是由哈佛大學謝曉亮團隊研發。與以前的技術相比,MALBAC的最大優勢是采用線性擴增方式。其核心技術在于通過五輪MDA預擴增得到完整擴增產物;增加退火步驟達到鏈內雜交自我鎖定,形成閉合的環狀分子,避免指數擴增;再通過常規PCR進行擴增。由于此時的模板更加均一,則可達到低偏倚的目的。

基因組測序數據及生物信息分析

對高通量數據的精準解讀是基因測序和精準醫療的關鍵。單細胞數據分析的基本流程與傳統序列分析相似,數據分析前首先要移除接頭序列(adapter)、連接序列(linker)、標簽序列(barcodes)、低質量堿基和污染DNA。然而兩者間具有顯著差異,傳統拼接方法是建立在一定的假設之上,如嵌合序列比例較少,讀取深度隨基因組呈泊松分布等。而單細胞數據由于表現出不均勻的覆蓋度和高比例的嵌合序列,則需要采用不同的分析方法進行數據預處理。一種方法是通過實驗方法或計算機算法將核酸文庫“標準化”,以降低擴增偏倚性;另外一種方法是將親緣關系很近的單細胞測序數據進行混合分析。從偏倚性的角度來看,混合分析可以顯著地提高樣品的平均覆蓋度。同時生物信息學分析軟件也為數據分析提供了極大的便利,如Smash Cell、Velvet-SC和SPAdes軟件等都能在一定程度上克服單細胞數據覆蓋度不均的問題,高效地完成序列拼接與測序數據分析。

SCS技術在腫瘤檢測中的應用

已有的研究表明，基因或基因組變異是腫瘤發生的根本原因，利用單細胞全基因組測序技術，可以對獲取的腫瘤細胞進行更為精確和深入的分析，發現正常細胞與腫瘤細胞差異，了解癌細胞的基因如何突變，以及腫瘤的來源、腫瘤的生長規律、屬于哪種基因型等，為早期檢測和診斷腫瘤和腫瘤的個體化治療提供指導。另外，腫瘤的異質性是導致腫瘤耐藥性問題的原因。如果能從單個腫瘤細胞水平對腫瘤單細胞進行測序，并找出一個腫瘤在單個細胞上的共同結構，揭露出每個腫瘤細胞的突變規律，這將為藥物研究、腫瘤的靶向治療提供基礎。

2008年，美國華盛頓醫學院的Ley等完成了對一位50多歲死于急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的患者的基因組測序工作。他們利用高級流式細胞術分離出細胞表面CD13、CD33和CD117陽性，但CD34陰性的腫瘤細胞，并檢測它的遺傳突變。最終在患者的腫瘤DNA中僅發現了10個可能與AML有關的遺傳突變，其中8個很罕見，這也是首次發現的與AML有關的基因。通過單細胞分析技術，測得每個腫瘤樣本細胞擁有9個突變。

2011年，Navin等利用DOP全基因組擴增及DNA測序對單個乳腺癌細胞進行了拷貝數變異的分析，進而推斷出細胞的群體結構和腫瘤的進化過程。但是由于該方法的基因覆蓋率較低，而且不能在單個核苷酸的分辨率上評價單個腫瘤細胞的遺傳學特征，故并不能檢測在腫瘤發展過程中發揮重要作用的單個核苷酸的改變。

2012年，華大基因首次利用以MDA為基礎的單細胞測序技術對原發性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)病人的單個骨髓細胞進行了測序并分析，篩查出在ET發病和進展中的驅動基因, 從而證實ET為單克隆來源的疾病。同時，也將該方法與經典方法進行比較，從而建立了具有高敏感性、高特異性、假陽性率低等特點的單細胞測序方法，為分析疾病的遺傳學結構特征及克 隆進化過程提供了新的思路。同樣的方法也用于分析單個腎癌細胞的單核苷酸突變特征，從而在更高的分辨能力上為評價基因改變的復雜性提供了更為優化的方法。

參考文獻：

[1]周瑩,黃華藝. 單細胞測序技術及其在腫瘤研究和臨床診斷中的應用[J]. 分子診斷與治療雜志,2017,9(03):147-153+172.

[2]董燕,宋程程,黃鶴. 單細胞測序技術研究進展[J]. 化學工業與工程,2015,32(01):71-78.

[3]Zong C,Lu S,Chapman AR,et al.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J].Science,2012,338(6114):1622-1626.

[4]Tang F,Barbacioru C,Wang Y,et al.m RNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell[J].NatMethods,2009,6(5):377-382.

[5]Navin N,Kendall J,Troge J,et al.Tumour evolution inferred by single-cell sequencing[J].Nature,2011,472(7341):90-94.

[6]Hou Y,Song L,Zhu P,et al.Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-Negative myeloproliferative neoplasm[J].Cell,2012,148(5):873-885.

[7]Xu X,Hou Y,Yin X,et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor[J].Cell,2012,148(5):886-895.

[8]Yu C,Yu J,Yao X,et al.Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer by single-cell sequencing[J].Cell Res,2014,24(6):701-712.

[9]Buenrostro JD,Wu B,Litzenburger UM,et al.Singlecell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation[J].Nature,2015,523(7561):486-490.

[10]Shapiro E,Biezuner T,Linnarsson S.Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize wholeorganism science[J].Nat Rev Genet,2013,14(9):618-630.

（文章來源: 南開細胞工程 作者：李思宇  科學網科學網轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）