引物：在Tris緩沖液中，引物可以低溫保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。除非有核酸酶的污染，引物一般非常穩(wěn)定。筆者使用過(guò)10 年前的引物，仍然好用。問(wèn)題的關(guān)鍵在于您的引物設(shè)計(jì)是否合理，使用過(guò)程是否規(guī)范。如果您懷疑引物有問(wèn)題，可以選擇重合。如果重合后，還沒(méi)有改善，請(qǐng)查其他 原因。引物到用戶手頭前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丟掉，引物溶解后可以測(cè)定一下OD，將所有引物的濃度調(diào)整到一致，對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定幫助。

       高溫聚合酶：高溫聚合酶是非常穩(wěn)定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶擴(kuò)增是有差異的，活性定量和標(biāo)示未必相同。選用表現(xiàn)一貫穩(wěn)定的酶，而不是最便宜的。

       dNTP: dNTP是PCR擴(kuò)增體系中最不穩(wěn)定的，反復(fù)凍融會(huì)使dNTP發(fā)生降解。dNTP是由 dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩爾組成，但是他們的穩(wěn)定性不同，發(fā)生降解的程度不同，導(dǎo)致4種dNTP的濃度不一致，即使不發(fā)生降解，4 種 dNTP如果濃度不等，PCR效率和正確率都會(huì)受到影響。建議分裝小包裝，減少反復(fù)動(dòng)容凍融的次數(shù)。

       緩沖液：緩沖液一般不容易出問(wèn)題，只是使用前需要徹底融化混勻使用。如果您PCR不熟悉，使用含Mg的緩沖液。緩沖液中可以加入適量的甘油、DMSO等增強(qiáng)劑，目的是改善高GC含量等疑難模板的擴(kuò)增。

       Mg2+:是TAQ活性所必須的，濃度過(guò)高過(guò)低對(duì)反應(yīng)都有比較大的影響。過(guò)低（<1mM），合成效率會(huì)下降，過(guò)高（>3mM），非特異性會(huì)加大。很多因素會(huì)使Mg2+的實(shí)際濃度受到影響，如TE中的EDTA, 反應(yīng)用的dNTP等都會(huì)螯和Mg.

       溫度：變性和退火溫度是主要需要考慮的。變性溫度過(guò)高（一般在90-94C），時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（一般45-60秒足夠），酶的活性會(huì)受到影響，同時(shí)影響產(chǎn)率。對(duì)于退火溫度，過(guò)低非特異性擴(kuò)增增加，過(guò)高產(chǎn)率會(huì)下降。需要根據(jù)引物的長(zhǎng)度，用途，組成確定退火溫度和時(shí)間。

       模板：PCR 的關(guān)鍵之一，模板不是越多越好。可以通過(guò)倍比稀釋來(lái)確定合適的濃度。純度,不是最重要，但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的試劑存在。模板的pH值接近中性為合適，否則會(huì)影響擴(kuò)增體系的pH值。

      （轉(zhuǎn)自：蘇州汶昌芯片官網(wǎng)）