所有的活組織都是由細胞組成的。為了研究細胞，科學家們將它們從原始組織中分離出來，并在受控和人造的環境中培育它們：這就是所謂的細胞培養。它于1907年首次使用，并在生物醫學實驗室中無處不在。細胞研究已經從在2D表面上進行演變為3D配置，以更接近地模擬人體內自然的3D棲息地：這就是我們所說的3D細胞培養。

圖1  細胞療法或再生醫學

1.三維細胞培養的目的

細胞療法或再生醫學，它包括生長在患者體內的細胞以修復受損組織。該領域包括幾個研究領域，如圖1所示。

用于藥物發現的3D 體外模型，其目的在于創建模擬活組織的3D細胞模型，以使大部分研究和藥物發現可以在體外而不是在動物（或人類）上完成。如圖2所示，3D體外模型旨在用于臨床試驗之前藥物發現的不同階段。

需要指出的是，細胞培養的另一個基本目標通常是使用細胞產生病毒或抗體。然而，傳統上這是通過二維細胞培養實現的，除了提高產量外，沒有什么需要向真正的三維細胞培養轉變。

圖2 用于藥物發現的3D 體外模型

Allied Market的研究估計，截至2015年，全球3D細胞市場為7.65億美元，預計2022年將增長30％至469.9億美元 [4]。他們將市場分為四類：藥物發現，癌癥研究，再生醫學和干細胞研究。根據我們更廣泛的分類，我們認為干細胞研究的一部分與再生醫學一起參與細胞治療。這是因為干細胞可以在體外分化成所需的細胞類型并被重新植入以修復組織。另一方面，我們認為，雖然癌癥和干細胞研究是他們自己的主要參與者，但他們在開發3D體外模型方面發揮了重要作用。因此，我們發現大部分市場有助于藥物發現的3D體外建模（圖3）。這在很大程度上是由于癌癥研究的一個重大推動，而癌癥研究本身就是世界范圍內癌癥發病率上升。

2.三維細胞培養的種類

微芯片、生物反應器、水凝膠等。

3.誰對3D細胞培養感興趣？

從地理位置上看，Allied Market Research估計2015年美國是三維細胞市場中最大的演員，占市場的41％，而歐洲占29％，亞太占19％，巴西，南非和沙特阿拉伯占11％（圖5）。2022年，他們估計美國和歐洲在市場上的重要性之間的差距將會減小，美國的貢獻率為35.3％，其次是歐洲的31.5％。

  三種主要類型的終端用戶參與3D細胞培養市場：生物技術和制藥公司，學術實驗室和合作研究實驗室。

4.為什么要多加一個第三維？

答案很簡單：因為在正常的環境中，細胞在三維空間中演化！現在確定細胞在3D中的表現與2D相比有很大不同。當3D中的細胞顯示出與2D中的細胞不同的反應時，這證明3D培養細胞用于藥物測試至關重要。

簡而言之，在3D中培養細胞允許細胞采用類似于體內發現的形態學和遷移模式。重新形成細胞的正常形態是重要的，因為它們的形狀可以直接影響它們的生物活性[8]。由于細胞遷移是許多疾?。ㄈ绨┌Y）中的一個中心過程，可以以藥理學為靶點，因此在體外忠實地復制遷移模式也很重要。一般來說，將細胞放置在3D中有效地增加了它們與其周圍環境的相互作用程度。它迫使它們在整個表面區域與它們的微環境（無論是支架，水凝膠還是其他細胞）進行更大程度的相互作用，就像它們在組織中所做的那樣。這是至關重要的，因為現在已知細胞與其ECM和微環境的相互作用對許多細胞功能是必不可少的[7-9]。另外，3D支持系統提供物理和生物化學錨定，可以被設計為在體內復制條件。構成細胞外基質的剛度，孔徑或配體可以被微調以模擬感興趣的組織。最后，3D細胞培養允許形成和研究更復雜的多細胞結構，例如球體，類器官或微血管。

5.用于藥物發現的3D體外模型

問題：藥物發現過程中真正的瓶頸

發現了一種在實驗室中成功治療疾病的藥物！這是一個里程碑。這通常意味著你已經在小鼠身上研究了藥物?，F在，您需要決定是否要花費大量的時間和金錢來通過嚴格的法規和更多的臨床前測試，直到您的藥物可以在人體臨床試驗中進行測試。只有發現......什么也不做，更糟的是，無法預料的副作用。

這是目前藥物發現過程的悲傷現實：在小鼠中使用的10種藥物中約有9種不在人體中 （圖7）。這些統計數據表明，問題很可能在于臨床前模型的預測能力：我們需要更好地重述人類對藥物反應的模型。特別是認為主要問題在于未能預測藥物的療效及其毒性。這是目前制藥行業面臨的巨大瓶頸。想象一下平均10年的花費和26億美元的無花果。仍然想知道為什么我們目前還沒有輕易治愈所有重大疾病？

我們需要重新考慮藥物發現系統，以便更有選擇性地過濾最終對人類起作用的藥物。其目的提高藥物發現過程的成功率，提高產量并降低相關成本。

不用說，新的試劑不能直接在人體上測試，事先沒有證據證明其潛在的毒性。相反，科學家傳統上一直使用替代模型來預測藥物在人類中的作用，例如動物或細胞模型，各有利弊（圖8）。請注意，圖8中列出的大多數優點和缺點適用于整個體外模型，即2D和3D蜂窩系統。

利用動物模型的主要優勢是無與倫比的。這意味著不僅可以評估藥物對細胞的局部影響（就像您在典型的簡單細胞研究中那樣），還可以評估其對整個身體（換句話說，對于多個器官）的系統影響。同樣，現在越來越明顯，細胞的微環境不僅影響細胞的生理機制，而且影響它們對藥物的反應[42]：因此，能夠研究藥物在動物中的作用是有利的，細胞類型正在實時交互。

雖然眾多強大的老鼠模型已經被描述，但它們的一些內在限制將難以克服。例如，動物的結果固有地基于非人類細胞和病原體，其可能不能完全地模擬人類藥理學反應。雖然研究已將人類細胞引入小鼠，但通常必須在免疫系統受損的小鼠中進行以防止人類細胞排斥。這反過來意味著動物模型不能正確反映免疫細胞的作用，應該考慮到這一點，因為很明顯免疫細胞是許多疾病的關鍵演員。在任何情況下，小鼠中引入的人類細胞都與鼠源的細胞微環境相互作用，這可能不能正確反映患者中發生的全人體細胞相互作用。相反，細胞研究可以完全由人類細胞組成。這避免了將動物結果外推到人體所造成的差異，這對免疫系統來說尤其明顯。盡管細胞模型仍未能總是預測人類對藥物的正確反應，但三維細胞培養領域仍處于起步階段，并且正在迅速發展; 因此可能比動物模型更適合填補臨床前預測模型中的當前缺口。事實上，許多新興的3D細胞培養產品已經在藥物發現過程中實施。傳統上，三維器官芯片已廣泛用于學術環境中的疾病建模。他們現在也正在轉向更多的藥理學應用，如藥物篩選，毒性和藥代動力學檢測。3D細胞培養也可以大大推進細胞治療領域。

6.細胞療法

細胞療法的目標是替換患者損傷或衰竭器官的組織。為了實現這一目標，在進行基礎體外研究和開發用于使細胞最終植入患者體內的方案方面作出了巨大努力，使用各種3D細胞培養產品。

支架裝載細胞并最終植入患者體內以局部再生目標組織。

三維支架可放置在生物反應器內以促進三維細胞的研究，優化組織生長并預測植入物在植入后的機械響應。這在生物反應器中得到了獨特的促進，因為它們能夠對培養環境提供如此嚴格的控制，并且能夠對組織進行物理調節，以模擬細胞在移植后會發生的作用力[2]。傳感器通常集成在生物反應器中，這有助于建立計算模型并獲得精確的實驗數據，以預測細胞對其植入體內的反應。

可以向患者注射   干細胞以促進組織特異性再生。有趣的是，已經表明與3D中的培養相比，3D中的生長干細胞具有臨床益處。例如，在3D中擴展球體中的間充質干細胞增強了它們在小鼠移植后的抗炎反應[15]。干細胞的球體也被用于提高臨床試驗中干細胞生產的產量。

類固醇是由干細胞或器官祖細胞體外發育而來的，它們自我組織成類似于器官的基本顯微解剖結構[16]。因此，人們認為他們有朝一日可以成為替代某些器官的移植來源。到今天為止，復制腎臟或冒號的類器官已經移植到小鼠身上，并且長期植入成功。

可以使用3D打印器官進行移植，而不是使用自組裝的類器官。雖然我們遠不能印刷整個器官的精確復制品，但已經成功地植入動物和人體中的膀胱，氣管，骨和軟骨的生物印刷品[17]。

最后，雖然微流體芯片往往與建立3D體外模型更相關，但是一些微流體工具已經被開發用于將細胞包封在3D ECM中，其可以植入患者體內。一項研究使用微流體裝置來制造水凝膠微纖維，然后將其用于在小鼠中包封和植入胰島。

7.微流控

微流控技術依賴于使用10-100微米高度或寬度的小通道來處理小體積流體。它們與傳統的3D細胞模型的關鍵特點是它們能夠更好地控制細胞，物理和生物化學微環境。這使得研究人員能夠模仿更全面的人體組織的復雜細胞模型[23]。

微流控芯片的設計可以由許多不同的通道或隔室組成，可以很容易地滿足研究人員的需求。這種區室化允許在生理長度尺度上對細胞分布進行獨特的空間控制，特別是對于不同細胞類型的共培養。現在許多微芯片已經將電子和機械致動器（例如閥門或開關）集成到微芯片上，從而有助于在同一芯片上實現多個連續步驟。這個概念通常被稱為芯片實驗室（lab-on-a-chip）：許多耗時的實驗室任務可以微型化并自動化集成到微流控芯片上。與傳統的宏觀測定相比，這種小型化還減少了所需的試劑和細胞的消耗，這降低了成本。

通道的存在允許在尺度上控制流量。這有助于跨越通道形成化學或物理梯度（例如細胞因子梯度或間質壓力），這在許多生物過程中是重要的。

微流控芯片中的細胞與顯微鏡物鏡之間的短距離能夠以比其他傳統宏觀體外系統更高的分辨率成像整個樣品。

微芯片 存在一些重要的限制：主要的是如果需要進行后續測試，則細胞難以檢索。另外，即使它們被檢索到，大小也可能不足以用于后續測試。然而這些挑戰正在逐漸在克服，以適應3D細胞培養市場的需求。

8.顯微鏡下3D細胞培養的未來

為了跟上藥物發現和細胞治療市場日益增長的需求，3D細胞培養面臨著許多挑戰。

第一個是可重復性：通常，3D細胞培養結果太可變。這種可變性的來源是三個方面。第一個是生物。眾所周知，細胞和細胞衍生的產物（如Matrigel或血清）在不同批次的生產中是不同的。第二個變異來源是基于用戶的：與3D細胞培養相關的許多程序如移液是手動完成的，因此容易受到用戶依賴性的變化影響。最后，很多方案可能受環境因素的影響，這些環境因素在測定中通常不受局部控制，例如溫度或濕度，這些因素可能會非常影響關鍵步驟，如3D凝膠聚合。同時，3D細胞培養程序遠非易事。他們需要專業和訓練有素的工作人員長。另外，這些任務耗時且成本高昂。

這些問題都指向了3D細胞培養領域的兩大需求：自動化和標準化。理想情況下，需要新產品來促進這些三維細胞培養過程，并減少人為干預，以最大限度地減少人為錯誤，加快并提高吞吐量和再現性。目前，細胞傳代或細胞擴增等任務的自動化正在進行中[2]。

3D細胞培養領域的另一個主要瓶頸是缺乏簡單的讀數。太多的研究都嚴重依賴3D成像來分析細胞形態，遷移或生存能力。這需要大量的時間，并需要使用昂貴的專用設備，如共聚焦顯微鏡。同時，還需要努力使分析方法標準化為了量化這些結果：重建3D圖像遠非易事。雖然有幾種3D重建軟件包可以在商業上獲得，但仍然很難定義，提取和量化來自這些復雜數據集的新變量。

微流控技術已經顯示出自動化和簡化繁瑣程序的巨大潛力。例如，一些微流控芯片具有自動化的ELISA方法[28]，并且將質譜結合到微流控芯片上。這最大限度地降低了成本和時間，但也有助于通過最大限度地減少人為干預來標準化結果 然而，朝著3D中細胞的操縱方向發展可能會更困難。雖然在微流控工具中操作流體是常規操作，但操作和混合不同粘度的溶液（如細胞懸浮液和3D水凝膠）更具挑戰性，因為它需要克服層流。

團隊還發現了將微流體芯片與簡單讀數相結合的方法。例如，Whitesides小組開發了比色紙基微流控技術，這樣檢測結果只是通過顏色變化顯示[29]。微流體芯片還具有促進個性化醫療的明顯優勢。

與此同時，努力開發具有受控環境的微流控芯片，就像生物反應器一樣。例如，重新創建缺氧環境的微流體工具已經被創造出來以模擬癌組織中的缺氧[30]。在另一項研究中，將微流控芯片連接到壓力控制器上，以便在細胞上施加周期性的壓力和變化，就像在肺部經歷的那樣[31]。換句話說，微流控芯片可以成為他們自己的微生物反應器，從而獲得生物反應器為3D細胞培養提供的許多益處。同時，集成傳感器的微流體正在開發中[32]，并且很可能在不久的將來變得更加普及。傳感器的存在與生物反應器非常相似，可以監測重要變量并有助于實現自動化和可追溯性。

微流體技術實現的自動化，小型化和高精度也將有助于標準化的程序，如細胞分化。事實上，需要分化的細胞如干細胞或單核細胞通常使用常規的宏觀體外方案進行分化，如果不控制化學和環境刺激，則可能容易產生大的變異。相反，微流控芯片可以精確控制培養基中營養物質的輸送，或氧濃度或流體特性，所有這些都可以影響干細胞的分化[33]。與此同時，這些芯片與蛋白質分析等傳感器的結合使得細胞分化過程中特定線索和信號通路的作用得以解開[34]。

由微流體促成的小型化和自動化提供了從科學中心向更其他方面的繁瑣程序的最終可能性。這已經用于測試肝功能的微流體[35]。相反，3D細胞培養的微流體應用目前需要許多步驟，只能在實驗室進行。然而，隨著研發進展，3D細胞培養微流體技術也可能成為即時診斷方法，如果在偏遠地區，直接在診所中使用也不是不可能。

獨特的微流控芯片可以使血管結構灌注。簡言之，當內皮細胞在適當的3D凝膠（例如纖維蛋白）中混合時，它們形成血管。雖然這可以以任何形式發生，但微流控芯片中的容器形成直接連接到微流體通道的開口[36]，[37]。這意味著可以通過微流體通道直接進入血管的血管內隔室，使得血管可以被顆粒，細胞或培養基灌注。這對于重新創造許多涉及脈管系統內細胞或分子運輸的生物學過程或僅僅是為了能夠在脈管系統內灌注藥物至關重要，因為它們將在患者中遞送。另一方面，類器官也可以在微流體芯片中生長以更好地控制其發展。那是，微流體隔室會限制并因此在一定程度上控制器官形狀和尺寸。最終，可以將類器官與微流體芯片內的血管網絡混合以獲得可灌注的器官型模型，并實現更復雜的組織模型。最終，將干細胞/類固醇結合到微流控芯片中意味著能夠使用患者衍生細胞創建個性化的細胞模型[27]。

與此同時，微流控系統在免疫細胞研究中具有獨特的優勢，正如其他地方廣泛審查的一樣[23]。這是因為它們允許建立細胞因子梯度，這對免疫細胞是重要的指導線索。微流體模型提供的流量控制對于在血液循環中重建免疫細胞運輸至關重要。沿著同樣的路線，先前討論的在微流控芯片上灌注血管的能力對于在血管內和血管內再生免疫細胞運輸也是獨一無二的，就像它們在體內一樣。最后，免疫細胞是高度移動的和異質細胞，必須經常將其視覺化以作為研究它們的手段。微芯片極大地促進了它們的高分辨率成像以進行詳細分析。

最后，微芯片一直是器官芯片的唯一技術努力[25]。正如我們之前所討論的，由微芯片提供的對微環境的增強控制使得該技術對于開發器官型模型而言是獨特的。另外，促進流動使得器官之間的連接和相互作用能夠使分子從一個器官轉移到另一個器官。這些相互作用已被證明是藥物測試的關鍵。例如，腸道和肝臟已經在芯片上結合，因為藥物首先通過腸道吸收，然后通過肝臟代謝[38]。他們的組合已被證明影響藥物的命運不同于膽汁肝臟分別培養的芯片[39]。在胃內加入胃還可能對模擬胃排空很重要，所有這些都會影響藥物的藥代動力學[40]。

最近，研究人員首次在3D芯片上進行了生物打印 -心臟芯片：這對促進和標準化芯片制造器件顯示出巨大的希望。此外，柔性傳感器被集成在組織的微架構中。

總而言之，我們相信微流體技術為3D細胞培養領域提供了很多可能，如果努力將其潛力從學術環境轉化為臨床方面。然而，所有這些都需要工程師，生物學家，臨床醫師，健康監管人員之間的合作和努力......